apoptosi - Apoptosis

apoptosi
Apoptosi DU145 cellule mosaic.jpg
Un etoposide -treated delle cellule del cancro alla prostata DU145 esplodendo in una cascata di corpi apoptotici. Le immagini secondarie sono state estratte da un video di microscopia time-lapse di 61 ore , creato utilizzando la microscopia quantitativa a contrasto di fase . Lo spessore ottico è codificato a colori. Con l'aumentare dello spessore, il colore cambia dal grigio al giallo, al rosso, al viola e infine al nero.
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Identificatori
Maglia D017209
Terminologia anatomica
L'apoptosi inizia quando il nucleo della cellula inizia a ridursi. Dopo il restringimento, la membrana plasmatica si gonfia e si piega attorno a diversi organelli. Le bolle continuano a formarsi e gli organelli si frammentano e si allontanano l'uno dall'altro.

L'apoptosi (dal greco antico ἀπόπτωσις , apóptōsis , "caduta") è una forma di morte cellulare programmata che si verifica negli organismi multicellulari . Gli eventi biochimici portano a cambiamenti cellulari caratteristici ( morfologia ) e morte. Questi cambiamenti includono blebbing , restringimento cellulare , frammentazione nucleare , condensazione della cromatina , frammentazione del DNA e decadimento dell'mRNA . L'uomo adulto medio perde tra 50 e 70 miliardi di cellule ogni giorno a causa dell'apoptosi. Per un bambino umano medio di età compresa tra 8 e 14 anni, circa 20-30 miliardi di cellule muoiono al giorno.

A differenza della necrosi , che è una forma di morte cellulare traumatica che deriva da un danno cellulare acuto, l'apoptosi è un processo altamente regolato e controllato che conferisce vantaggi durante il ciclo di vita di un organismo. Ad esempio, la separazione delle dita delle mani e dei piedi in un embrione umano in via di sviluppo si verifica perché le cellule tra le dita subiscono l'apoptosi. A differenza della necrosi, l'apoptosi produce frammenti cellulari chiamati corpi apoptotici che i fagociti sono in grado di inghiottire e rimuovere prima che il contenuto della cellula possa riversarsi sulle cellule circostanti e danneggiarle.

Poiché l'apoptosi non può fermarsi una volta iniziata, è un processo altamente regolamentato. L'apoptosi può essere avviata attraverso uno dei due percorsi. Nella via intrinseca la cellula si uccide perché percepisce lo stress cellulare , mentre nella via estrinseca la cellula si uccide a causa di segnali provenienti da altre cellule. Segnali esterni deboli possono anche attivare la via intrinseca dell'apoptosi. Entrambi i percorsi inducono la morte cellulare attivando le caspasi , che sono proteasi , o enzimi che degradano le proteine. Le due vie attivano entrambe le caspasi iniziatrici, che poi attivano le caspasi esecutrici, che poi uccidono la cellula degradando le proteine ​​indiscriminatamente.

Oltre alla sua importanza come fenomeno biologico, i processi apoptotici difettosi sono stati implicati in un'ampia varietà di malattie. Un'eccessiva apoptosi provoca atrofia , mentre una quantità insufficiente provoca una proliferazione cellulare incontrollata, come il cancro . Alcuni fattori come i recettori Fas e le caspasi promuovono l'apoptosi, mentre alcuni membri della famiglia di proteine Bcl-2 inibiscono l'apoptosi.

Scoperta ed etimologia

Lo scienziato tedesco Carl Vogt fu il primo a descrivere il principio dell'apoptosi nel 1842. Nel 1885, l'anatomista Walther Flemming fornì una descrizione più precisa del processo di morte cellulare programmata. Tuttavia, non è stato fino al 1965 che l'argomento è risorto. Mentre studiava i tessuti utilizzando la microscopia elettronica, John Kerr dell'Università del Queensland è stato in grado di distinguere l'apoptosi dalla morte cellulare traumatica. A seguito della pubblicazione di un documento che descrive il fenomeno, Kerr è stato invitato ad unirsi ad Alastair Currie , così come Andrew Wyllie , che era studente laureato di Currie, all'Università di Aberdeen . Nel 1972, il trio pubblicò un articolo fondamentale sul British Journal of Cancer . Kerr aveva inizialmente usato il termine necrosi cellulare programmata, ma nell'articolo il processo di morte cellulare naturale era chiamato apoptosi . Kerr, Wyllie e Currie hanno attribuito a James Cormack, professore di lingua greca all'Università di Aberdeen, il merito di aver suggerito il termine apoptosi. Kerr ha ricevuto il premio Paul Ehrlich e Ludwig Darmstaedter il 14 marzo 2000 per la sua descrizione dell'apoptosi. Ha condiviso il premio con il biologo di Boston H. Robert Horvitz .

Per molti anni, né "apoptosi" né "morte cellulare programmata" sono stati un termine molto citato. Due scoperte hanno portato la morte cellulare dall'oscurità a un importante campo di ricerca: l'identificazione dei componenti del controllo della morte cellulare e dei meccanismi effettori e il collegamento delle anomalie nella morte cellulare alle malattie umane, in particolare il cancro.

Il Premio Nobel per la Medicina 2002 è stato assegnato a Sydney Brenner , H. Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro nell'identificare i geni che controllano l'apoptosi. I geni sono stati identificati da studi nel nematode C. elegans e gli omologhi di questi geni funzionano nell'uomo per regolare l'apoptosi.

John Sulston ha vinto il Premio Nobel per la Medicina nel 2002, per la sua ricerca pionieristica sull'apoptosi.

In greco, l'apoptosi si traduce nella "caduta" delle foglie da un albero. Cormack, professore di lingua greca, ha reintrodotto il termine per uso medico poiché aveva un significato medico per i greci oltre duemila anni prima. Ippocrate usava il termine per significare "la caduta delle ossa". Galeno estese il suo significato a "la caduta delle croste". Cormack era senza dubbio a conoscenza di questo uso quando ha suggerito il nome. Il dibattito continua sopra la pronuncia corretta, con il parere diviso tra una pronuncia con la seconda p silenziosa ( / Æ p ə t s ɪ s / ap-ə- TOH -sis ) e il secondo p pronunciato ( / p ə p t s ɪ s / ), come nell'originale greco. In inglese, la p del gruppo consonantico greco -pt- è tipicamente muta all'inizio di una parola (es. pterodattilo , Tolomeo ), ma articolata quando usata in forme combinate precedute da vocale, come in elicottero o negli ordini di insetti: ditteri , lepidotteri , ecc.

Nel documento originale di Kerr, Wyllie & Currie, c'è una nota a piè di pagina relativa alla pronuncia:

Siamo molto grati al Professor James Cormack del Dipartimento di Greco, Università di Aberdeen, per aver suggerito questo termine. La parola "apoptosi" ( ἀπόπτωσις ) è usata in greco per descrivere la "caduta" o la "caduta" dei petali dei fiori o delle foglie degli alberi. Per mostrare chiaramente la derivazione, proponiamo che l'accento sia sulla penultima sillaba, la seconda metà della parola essendo pronunciata come "ptosis" (con la "p" muta), che deriva dalla stessa radice "cadere", ed è già usato per descrivere l'abbassamento della palpebra superiore.

Meccanismi di attivazione

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Controllo dei meccanismi apoptotici
Controllo dei meccanismi apoptotici

L'inizio dell'apoptosi è strettamente regolato da meccanismi di attivazione, perché una volta iniziata l'apoptosi, porta inevitabilmente alla morte della cellula. I due meccanismi di attivazione meglio conosciuti sono la via intrinseca (chiamata anche via mitocondriale ) e la via estrinseca. La via intrinseca è attivata da segnali intracellulari generati quando le cellule sono stressate e dipende dal rilascio di proteine ​​dallo spazio intermembrana dei mitocondri. La via estrinseca è attivata da ligandi extracellulari che si legano ai recettori di morte sulla superficie cellulare, che porta alla formazione del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC).

Una cellula avvia la segnalazione apoptotica intracellulare in risposta a uno stress, che può portare al suicidio cellulare. Il legame dei recettori nucleari da parte di glucocorticoidi , calore, radiazioni, privazione di nutrienti, infezione virale, ipossia , aumento della concentrazione intracellulare di acidi grassi liberi e aumento della concentrazione intracellulare di calcio , ad esempio, a causa di un danno alla membrana, possono innescare il rilascio di apoptosi intracellulare segnali da una cellula danneggiata. Un certo numero di componenti cellulari, come la poli ADP ribosio polimerasi , può anche aiutare a regolare l'apoptosi. Fluttuazioni di singole cellule sono state osservate in studi sperimentali sull'apoptosi indotta da stress.

Prima che l'effettivo processo di morte cellulare venga accelerato dagli enzimi, i segnali apoptotici devono far sì che le proteine ​​regolatrici avviino la via dell'apoptosi. Questo passaggio consente a quei segnali di causare la morte cellulare o l'interruzione del processo, nel caso in cui la cellula non debba più morire. Diverse proteine ​​sono coinvolte, ma sono stati identificati due metodi principali di regolazione: il targeting della funzionalità dei mitocondri o la trasduzione diretta del segnale tramite proteine ​​adattatrici ai meccanismi apoptotici. Un percorso estrinseco per l'inizio identificato in diversi studi sulle tossine è un aumento della concentrazione di calcio all'interno di una cellula causato dall'attività del farmaco, che può anche causare apoptosi attraverso una proteasi che si lega al calcio calpaina .

Via intrinseca

La via intrinseca è anche conosciuta come via mitocondriale. I mitocondri sono essenziali per la vita multicellulare. Senza di loro, una cellula smette di respirare aerobicamente e muore rapidamente. Questo fatto costituisce la base per alcuni percorsi apoptotici. Le proteine ​​apoptotiche che prendono di mira i mitocondri li influenzano in modi diversi. Possono causare rigonfiamento mitocondriale attraverso la formazione di pori della membrana, oppure possono aumentare la permeabilità della membrana mitocondriale e causare la fuoriuscita di effettori apoptotici. Sono strettamente correlati alla via intrinseca e i tumori insorgono più frequentemente attraverso la via intrinseca rispetto alla via estrinseca a causa della sensibilità. C'è anche un numero crescente di prove che indicano che l'ossido nitrico è in grado di indurre l'apoptosi aiutando a dissipare il potenziale di membrana dei mitocondri e quindi a renderlo più permeabile. L'ossido nitrico è stato implicato nell'iniziare e nell'inibire l'apoptosi attraverso la sua possibile azione come molecola segnale delle vie successive che attivano l'apoptosi.

Durante l'apoptosi, il citocromo c viene rilasciato dai mitocondri attraverso l'azione delle proteine Bax e Bak . Il meccanismo di questo rilascio è enigmatico, ma sembra derivare da una moltitudine di omo- ed eterodimeri Bax/Bak inseriti nella membrana esterna. Una volta rilasciato, il citocromo c si lega al fattore di attivazione della proteasi apoptotica – 1 ( Apaf-1 ) e all'ATP , che quindi si legano alla pro-caspasi-9 per creare un complesso proteico noto come apoptosoma . L'apoptosoma scinde la pro-caspasi nella sua forma attiva di caspasi-9 , che a sua volta scinde e attiva la pro-caspasi nell'effettore caspasi-3 .

I mitocondri rilasciano anche proteine ​​note come SMAC (secondo attivatore delle caspasi derivato dai mitocondri ) nel citosol della cellula in seguito all'aumento della permeabilità delle membrane dei mitocondri. SMAC si lega alle proteine ​​che inibiscono l'apoptosi (IAP) disattivandole e impedendo alle IAP di arrestare il processo e quindi di consentire l'apoptosi. L'IAP normalmente sopprime anche l'attività di un gruppo di cisteina proteasi chiamate caspasi , che effettuano la degradazione della cellula. Pertanto, gli enzimi di degradazione effettivi possono essere regolati indirettamente dalla permeabilità mitocondriale.

Via estrinseca

Panoramica delle vie di trasduzione del segnale.
Panoramica della segnalazione di TNF (a sinistra) e Fas (a destra) nell'apoptosi, un esempio di trasduzione del segnale diretto.

Sono state suggerite due teorie sull'inizio diretto dei meccanismi apoptotici nei mammiferi: il modello indotto dal TNF ( fattore di necrosi tumorale ) e il modello mediato dal ligando Fas-Fas , entrambi che coinvolgono recettori della famiglia dei recettori del TNF (TNFR) accoppiati a segnali estrinseci .

percorso TNF

Il TNF-alfa è una citochina prodotta principalmente dai macrofagi attivati ed è il principale mediatore estrinseco dell'apoptosi. La maggior parte delle cellule del corpo umano ha due recettori per il TNF-alfa: TNFR1 e TNFR2 . È stato dimostrato che il legame del TNF-alfa al TNFR1 avvia il percorso che porta all'attivazione della caspasi attraverso le proteine ​​di membrana intermedie del dominio di morte associato al recettore del TNF ( TRADD ) e della proteina del dominio di morte associato al Fas ( FADD ). cIAP1 /2 può inibire la segnalazione di TNF-α legandosi a TRAF2 . FLIP inibisce l'attivazione della caspasi-8. Il legame di questo recettore può anche portare indirettamente all'attivazione di fattori di trascrizione coinvolti nella sopravvivenza cellulare e nelle risposte infiammatorie. Tuttavia, la segnalazione attraverso TNFR1 potrebbe anche indurre l'apoptosi in modo indipendente dalla caspasi. Il legame tra TNF-alfa e apoptosi mostra perché una produzione anormale di TNF-alfa gioca un ruolo fondamentale in diverse malattie umane, specialmente nelle malattie autoimmuni . La superfamiglia dei recettori TNF-alfa comprende anche i recettori della morte (DR), come DR4 e DR5 . Questi recettori si legano alla proteina TRAIL e mediano l'apoptosi. L'apoptosi è noto per essere uno dei meccanismi primari della terapia mirata del cancro. Recentemente sono stati progettati ibridi luminescenti di iridio complesso-peptide (IPH), che imitano TRAIL e si legano ai recettori di morte sulle cellule tumorali, inducendo così la loro apoptosi.

percorso veloce

Il recettore fas (primo segnale di apoptosi) – (noto anche come Apo-1 o CD95 ) è una proteina transmembrana della famiglia del TNF che si lega al ligando Fas (FasL). L'interazione tra Fas e FasL porta alla formazione del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC), che contiene FADD, caspasi-8 e caspasi-10. In alcuni tipi di cellule (tipo I), la caspasi-8 elaborata attiva direttamente altri membri della famiglia delle caspasi e innesca l'esecuzione dell'apoptosi della cellula. In altri tipi di cellule (tipo II), il Fas- DISC avvia un ciclo di feedback che si sviluppa a spirale in un aumento del rilascio di fattori proapoptotici dai mitocondri e nell'attivazione amplificata della caspasi-8.

Componenti comuni

In seguito all'attivazione di TNF-R1 e Fas nelle cellule di mammifero viene stabilito un equilibrio tra membri proapoptotici ( BAX , BID , BAK o BAD ) e anti-apoptotici ( Bcl-Xl e Bcl-2 ) della famiglia Bcl-2 . Questo equilibrio è la proporzione di omodimeri proapoptotici che si formano nella membrana esterna del mitocondrio. Gli omodimeri proapoptotici sono necessari per rendere la membrana mitocondriale permeabile al rilascio di attivatori della caspasi come il citocromo ce lo SMAC. Il controllo delle proteine ​​proapoptotiche in condizioni cellulari normali di cellule non apoptotiche è compreso in modo incompleto, ma in generale, Bax o Bak sono attivati ​​dall'attivazione di proteine ​​solo BH3, parte della famiglia Bcl-2 .

caspasi

Le caspasi giocano un ruolo centrale nella trasduzione dei segnali apoptotici dell'ER. Le caspasi sono proteine ​​che sono proteasi aspartato-specifiche altamente conservate e dipendenti dalla cisteina. Esistono due tipi di caspasi: caspasi iniziatrici, caspasi 2,8,9,10,11,12 e caspasi effettrici, caspasi 3,6,7. L'attivazione delle caspasi iniziatori richiede il legame con una specifica proteina attivatrice oligomerica . Le caspasi effettrici vengono quindi attivate da queste caspasi iniziatrici attive attraverso la scissione proteolitica . Le caspasi effettrici attive degradano poi proteoliticamente una serie di proteine ​​intracellulari per eseguire il programma di morte cellulare.

Via apoptotica indipendente dalla caspasi

Esiste anche una via apoptotica indipendente dalla caspasi che è mediata da AIF ( fattore che induce l'apoptosi ).

Modello di apoptosi negli anfibi

La rana anfibia Xenopus laevis funge da sistema modello ideale per lo studio dei meccanismi dell'apoptosi. Infatti, lo iodio e la tiroxina stimolano anche la spettacolare apoptosi delle cellule delle branchie, della coda e delle pinne larvali nella metamorfosi degli anfibi, e stimolano l'evoluzione del loro sistema nervoso trasformando il girino acquatico, vegetariano, nella rana terrestre e carnivora .

Regolatori negativi dell'apoptosi

La regolazione negativa dell'apoptosi inibisce le vie di segnalazione della morte cellulare, aiutando i tumori a eludere la morte cellulare e sviluppando la resistenza ai farmaci . Il rapporto tra proteine ​​anti-apoptotiche (Bcl-2) e pro-apoptotiche (Bax) determina se una cellula vive o muore. Molte famiglie di proteine ​​agiscono come regolatori negativi classificati in fattori antiapoptotici, come le proteine IAP e Bcl-2 o fattori di sopravvivenza come cFLIP , BNIP3 , FADD , Akt e NF-κB .

Cascata proteolitica delle caspasi: uccidere la cellula

Molti percorsi e segnali portano all'apoptosi, ma questi convergono su un unico meccanismo che in realtà provoca la morte della cellula. Dopo che una cellula riceve uno stimolo, subisce una degradazione organizzata degli organelli cellulari da parte delle caspasi proteolitiche attivate . Oltre alla distruzione degli organelli cellulari, l' mRNA viene rapidamente e globalmente degradato da un meccanismo non ancora completamente caratterizzato. Il decadimento dell'mRNA viene attivato molto presto nell'apoptosi.

Una cellula in apoptosi mostra una serie di cambiamenti morfologici caratteristici. Le prime alterazioni includono:

  1. Il restringimento e l'arrotondamento delle cellule si verificano a causa della retrazione dei lamellipodi e della rottura del citoscheletro proteico da parte delle caspasi.
  2. Il citoplasma appare denso e gli organelli appaiono strettamente impacchettati.
  3. La cromatina subisce la condensazione in chiazze compatte contro l' involucro nucleare (noto anche come involucro perinucleare) in un processo noto come picnosi , un segno distintivo dell'apoptosi.
  4. L'involucro nucleare diventa discontinuo e il DNA al suo interno viene frammentato in un processo denominato carioressi . Il nucleo si rompe in diversi corpi cromatinici discreti o unità nucleosomiali a causa della degradazione del DNA.

L'apoptosi progredisce rapidamente e i suoi prodotti vengono rimossi rapidamente, rendendo difficile l'individuazione o la visualizzazione su sezioni di istologia classica. Durante la carioressi, l' attivazione dell'endonucleasi lascia brevi frammenti di DNA, di dimensioni regolari. Questi danno un caratteristico aspetto "a scala" su gel di agar dopo l' elettroforesi . I test per il DNA laddering differenziano l'apoptosi dalla morte cellulare ischemica o tossica.

Smontaggio delle cellule apoptotiche

Diversi passaggi nel disassemblaggio delle cellule apoptotiche.

Prima che la cellula apoptotica venga eliminata, c'è un processo di disassemblaggio. Ci sono tre passaggi riconosciuti nello smontaggio delle cellule apoptotiche:

  1. Blebbing della membrana: la membrana cellulare mostra gemme irregolari note come blebs . Inizialmente si tratta di bolle di superficie più piccole. Successivamente questi possono crescere in cosiddetti bleb di membrana dinamici più grandi. Un importante regolatore del blebbing della membrana cellulare apoptotica è ROCK1 (proteina chinasi 1 contenente coiled-coil associata a rho).
  2. Formazione di protrusioni di membrana: alcuni tipi di cellule, in condizioni specifiche, possono sviluppare diversi tipi di estensioni lunghe e sottili della membrana cellulare chiamate protrusioni di membrana. Sono stati descritti tre tipi: punte di microtubuli , apoptopodi ( piedi della morte ) e apoptopodi con perline (quest'ultimo ha un aspetto di perline su un filo). La pannexina 1 è un componente importante dei canali di membrana coinvolti nella formazione di apoptopodi e apoptopodi con perline.
  3. Frammentazione : La cellula si scompone in più vescicole chiamate corpi apoptotici , che vanno incontro a fagocitosi . Le sporgenze della membrana plasmatica possono aiutare ad avvicinare i corpi apoptotici ai fagociti.

Rimozione di cellule morte

La rimozione delle cellule morte da parte dei fagociti vicini è stata definita efferocitosi . Le cellule morenti che subiscono le fasi finali dell'apoptosi mostrano molecole fagocitotiche, come la fosfatidilserina , sulla loro superficie cellulare. La fosfatidilserina si trova normalmente sulla superficie interna dei lembi della membrana plasmatica, ma viene ridistribuita durante l'apoptosi sulla superficie extracellulare da una proteina nota come scramblasi . Queste molecole marcano la cellula per la fagocitosi da parte delle cellule che possiedono i recettori appropriati, come i macrofagi. La rimozione delle cellule morenti da parte dei fagociti avviene in modo ordinato senza provocare una risposta infiammatoria . Durante l'apoptosi l'RNA e il DNA cellulare vengono separati l'uno dall'altro e smistati in diversi corpi apoptotici; la separazione dell'RNA viene avviata come segregazione nucleolare.

knock-out del percorso

Sono stati effettuati molti knock-out nelle vie dell'apoptosi per testare la funzione di ciascuna delle proteine. Diverse caspasi, oltre a APAF1 e FADD , sono state mutate per determinare il nuovo fenotipo. Per creare un knockout del fattore di necrosi tumorale (TNF), un esone contenente i nucleotidi 3704-5364 è stato rimosso dal gene. Questo esone codifica una porzione del dominio TNF maturo, così come la sequenza leader, che è una regione altamente conservata necessaria per una corretta elaborazione intracellulare. I topi TNF-/- si sviluppano normalmente e non hanno grosse anomalie strutturali o morfologiche. Tuttavia, dopo l'immunizzazione con SRBC (globuli rossi di pecora), questi topi hanno dimostrato una carenza nella maturazione di una risposta anticorpale; erano in grado di generare livelli normali di IgM, ma non potevano sviluppare livelli di IgG specifici. Apaf-1 è la proteina che attiva la caspasi 9 mediante scissione per iniziare la cascata di caspasi che porta all'apoptosi. Poiché una mutazione -/- nel gene APAF-1 è letale per l'embrione, è stata utilizzata una strategia di trappola genica per generare un topo APAF-1 -/-. Questo test viene utilizzato per interrompere la funzione genica creando una fusione genica intragenica. Quando una trappola del gene APAF-1 viene introdotta nelle cellule, si verificano molti cambiamenti morfologici, come la spina bifida, la persistenza delle reti interdigitali e il cervello aperto. Inoltre, dopo il giorno embrionale 12.5, il cervello degli embrioni ha mostrato diversi cambiamenti strutturali. Le cellule APAF-1 sono protette dagli stimoli di apoptosi come l'irradiazione. Un topo knock-out BAX-1 mostra una normale formazione del proencefalo e una diminuzione della morte cellulare programmata in alcune popolazioni neuronali e nel midollo spinale, portando ad un aumento dei motoneuroni.

Le proteine ​​della caspasi sono parti integranti della via dell'apoptosi, quindi ne consegue che i knock-out prodotti hanno risultati dannosi variabili. Un knock-out della caspasi 9 porta a una grave malformazione cerebrale. Un knock-out della caspasi 8 porta a insufficienza cardiaca e quindi letalità embrionale. Tuttavia, con l'uso della tecnologia cre-lox, è stato creato un knock-out della caspasi 8 che mostra un aumento delle cellule T periferiche, una risposta delle cellule T alterata e un difetto nella chiusura del tubo neurale. Questi topi sono risultati resistenti all'apoptosi mediata da CD95, TNFR, ecc. ma non resistenti all'apoptosi causata dall'irradiazione UV, dai farmaci chemioterapici e da altri stimoli. Infine, un knock-out della caspasi 3 è stato caratterizzato da masse cellulari ectopiche nel cervello e caratteristiche apoptotiche anormali come blebbing della membrana o frammentazione nucleare. Una caratteristica notevole di questi topi KO è che hanno un fenotipo molto ristretto: i topi Casp3, 9, APAF-1 KO hanno deformazioni del tessuto neurale e FADD e Casp 8 KO hanno mostrato uno sviluppo cardiaco difettoso, tuttavia, in entrambi i tipi di KO altri organi sviluppato normalmente e alcuni tipi di cellule erano ancora sensibili agli stimoli apoptotici suggerendo che esistono vie proapoptotiche sconosciute.

Metodi per distinguere le cellule apoptotiche da quelle necrotiche (necroptotiche)

Imaging a lungo termine di cellule vive (12 ore) di pre-adipociti multinucleati di topo che cercano di subire la mitosi. A causa dell'eccesso di materiale genetico la cellula non riesce a replicarsi e muore per apoptosi.

Al fine di eseguire l'analisi delle cellule apoptotiche rispetto a quelle necrotiche (necroptotiche), si può eseguire l'analisi della morfologia mediante imaging di cellule vive senza etichetta , microscopia time-lapse , fluorocitometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione . Esistono anche varie tecniche biochimiche per l'analisi dei marcatori della superficie cellulare (esposizione alla fosfatidilserina rispetto alla permeabilità cellulare mediante citometria a flusso ), marcatori cellulari come la frammentazione del DNA (citometria a flusso), l'attivazione della caspasi, la scissione del Bid e il rilascio del citocromo c ( Western blotting ). È importante sapere come le cellule necrotiche primarie e secondarie possono essere distinte mediante l'analisi del surnatante per le caspasi, HMGB1 e il rilascio di citocheratina 18. Tuttavia, non sono stati ancora identificati marcatori di superficie o biochimici distinti di morte delle cellule necrotiche e solo marcatori negativi sono disponibili. Questi includono l'assenza di marcatori apoptotici (attivazione della caspasi, rilascio del citocromo c e frammentazione del DNA oligonucleosomiale) e la cinetica differenziale dei marcatori di morte cellulare (esposizione alla fosfatidilserina e permeabilizzazione della membrana cellulare). Una selezione di tecniche che possono essere utilizzate per distinguere l'apoptosi dalle cellule necroptotiche può essere trovata in questi riferimenti.

Implicazione nella malattia

Una sezione di fegato di topo che mostra diverse cellule apoptotiche, indicate da frecce
Una sezione di fegato di topo colorata per mostrare le cellule in fase di apoptosi (arancione)
Ultrastruttura dei cardiomiociti neonatali dopo anossia-riossigenazione.

Percorsi difettosi

I diversi tipi di vie apoptotiche contengono una moltitudine di diversi componenti biochimici, molti dei quali non ancora compresi. Poiché un percorso è di natura più o meno sequenziale, rimuovere o modificare un componente porta a un effetto in un altro. In un organismo vivente, ciò può avere effetti disastrosi, spesso sotto forma di malattia o disturbo. Una discussione su ogni malattia causata dalla modificazione delle varie vie apoptotiche sarebbe impraticabile, ma il concetto che sovrasta ciascuna di esse è lo stesso: il normale funzionamento della via è stato interrotto in modo tale da compromettere la capacità della cellula di subire apoptosi normale. Ciò si traduce in una cellula che vive oltre la sua "data di scadenza" ed è in grado di replicare e trasmettere qualsiasi macchinario difettoso alla sua progenie, aumentando la probabilità che la cellula diventi cancerosa o malata.

Un esempio recentemente descritto di questo concetto in azione può essere visto nello sviluppo di un cancro ai polmoni chiamato NCI-H460 . L' inibitore legato all'X della proteina dell'apoptosi ( XIAP ) è sovraespresso nelle cellule della linea cellulare H460 . Gli XIAP si legano alla forma elaborata della caspasi-9 e sopprimono l'attività dell'attivatore apoptotico del citocromo c , pertanto la sovraespressione porta ad una diminuzione del numero di agonisti proapoptotici. Di conseguenza, l'equilibrio degli effettori anti-apoptotici e proapoptotici è sconvolto a favore dei primi e le cellule danneggiate continuano a replicarsi nonostante siano dirette a morire. Difetti nella regolazione dell'apoptosi nelle cellule tumorali si verificano spesso a livello di controllo dei fattori di trascrizione. Come esempio particolare, i difetti nelle molecole che controllano il fattore di trascrizione NF-κB nel cancro cambiano la modalità di regolazione trascrizionale e la risposta ai segnali apoptotici, per ridurre la dipendenza dal tessuto a cui appartiene la cellula. Questo grado di indipendenza dai segnali di sopravvivenza esterni, può consentire la metastasi del cancro.

Disregolazione di p53

La proteina soppressore del tumore p53 si accumula quando il DNA è danneggiato a causa di una catena di fattori biochimici. Parte di questo percorso include alfa- interferone e beta-interferone, che inducono la trascrizione del gene p53 , con conseguente aumento del livello della proteina p53 e miglioramento dell'apoptosi delle cellule tumorali. p53 impedisce alla cellula di replicarsi fermando il ciclo cellulare in G1, o interfase, per dare alla cellula il tempo di ripararsi, tuttavia indurrà l'apoptosi se il danno è esteso e gli sforzi di riparazione falliscono. Qualsiasi interruzione della regolazione dei geni p53 o dell'interferone provocherà un'apoptosi compromessa e la possibile formazione di tumori.

Inibizione

L'inibizione dell'apoptosi può provocare una serie di tumori, malattie infiammatorie e infezioni virali. Inizialmente si credeva che l'accumulo associato di cellule fosse dovuto ad un aumento della proliferazione cellulare, ma ora è noto che è dovuto anche a una diminuzione della morte cellulare. La più comune di queste malattie è il cancro, la malattia dell'eccessiva proliferazione cellulare, che è spesso caratterizzata da una sovraespressione dei membri della famiglia IAP . Di conseguenza, le cellule maligne sperimentano una risposta anormale all'induzione dell'apoptosi: i geni che regolano il ciclo (come p53, ras o c-myc) sono mutati o inattivati ​​nelle cellule malate e anche altri geni (come bcl-2) modificano la loro espressione nei tumori. Alcuni fattori apoptotici sono vitali durante la respirazione mitocondriale, ad esempio il citocromo C. L'inattivazione patologica dell'apoptosi nelle cellule tumorali è correlata a frequenti spostamenti metabolici respiratori verso la glicolisi (osservazione nota come "ipotesi di Warburg".

cellula HeLa

L'apoptosi nelle cellule HeLa è inibita dalle proteine ​​prodotte dalla cellula; queste proteine ​​inibitorie prendono di mira le proteine ​​che sopprimono il tumore del retinoblastoma. Queste proteine ​​che sopprimono il tumore regolano il ciclo cellulare, ma sono rese inattive quando legate a una proteina inibitoria. HPV E6 ed E7 sono proteine ​​inibitorie espresse dal papillomavirus umano, essendo l'HPV responsabile della formazione del tumore cervicale da cui derivano le cellule HeLa. HPV E6 fa sì che p53, che regola il ciclo cellulare, diventi inattivo. L'HPV E7 si lega alle proteine ​​che sopprimono il tumore del retinoblastoma e ne limita la capacità di controllare la divisione cellulare. Queste due proteine ​​inibitorie sono parzialmente responsabili dell'immortalità delle cellule HeLa inibendo l'apoptosi. Il virus del cimurro canino (CDV) è in grado di indurre l'apoptosi nonostante la presenza di queste proteine ​​inibitorie. Questa è un'importante proprietà oncolitica del CDV: questo virus è in grado di uccidere le cellule del linfoma canino. Le oncoproteine ​​E6 ed E7 lasciano ancora inattiva p53, ma non sono in grado di evitare l'attivazione delle caspasi indotte dallo stress dell'infezione virale. Queste proprietà oncolitiche hanno fornito un collegamento promettente tra CDV e apoptosi del linfoma, che può portare allo sviluppo di metodi di trattamento alternativi sia per il linfoma canino che per il linfoma non-Hodgkin umano. Si pensa che i difetti nel ciclo cellulare siano responsabili della resistenza alla chemioterapia o alle radiazioni da parte di alcune cellule tumorali, quindi un virus che può indurre l'apoptosi nonostante i difetti nel ciclo cellulare è utile per il trattamento del cancro.

Trattamenti

Il principale metodo di trattamento per la potenziale morte per malattie correlate alla segnalazione comporta l'aumento o la diminuzione della suscettibilità dell'apoptosi nelle cellule malate, a seconda che la malattia sia causata dall'inibizione o dall'eccesso di apoptosi. Ad esempio, i trattamenti mirano a ripristinare l'apoptosi per curare malattie con morte cellulare carente e ad aumentare la soglia apoptotica per trattare malattie coinvolte con un'eccessiva morte cellulare. Per stimolare l'apoptosi, si può aumentare il numero di ligandi del recettore della morte (come TNF o TRAIL), antagonizzare la via anti-apoptotica di Bcl-2 o introdurre mimetici Smac per inibire l'inibitore (IAP). L'aggiunta di agenti come Herceptin, Iressa o Gleevec agisce per fermare il ciclo delle cellule e provoca l'attivazione dell'apoptosi bloccando la crescita e la segnalazione di sopravvivenza più a monte. Infine, l'aggiunta di complessi p53- MDM2 sposta p53 e attiva la via p53, portando all'arresto del ciclo cellulare e all'apoptosi. Molti metodi diversi possono essere utilizzati per stimolare o inibire l'apoptosi in vari punti lungo la via di segnalazione della morte.

L'apoptosi è un programma di morte cellulare multi-step e multi-pathway che è inerente a ogni cellula del corpo. Nel cancro, il rapporto di divisione cellulare dell'apoptosi è alterato. Il trattamento del cancro mediante chemioterapia e irradiazione uccide le cellule bersaglio principalmente inducendo l'apoptosi.

Apoptosi iperattiva

D'altra parte, la perdita del controllo della morte cellulare (con conseguente eccesso di apoptosi) può portare a malattie neurodegenerative, malattie ematologiche e danni ai tessuti. È interessante notare che i neuroni che si basano sulla respirazione mitocondriale subiscono l'apoptosi nelle malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e il Parkinson. (un'osservazione nota come "ipotesi di Warburg inversa"). Inoltre, esiste una comorbidità epidemiologica inversa tra malattie neurodegenerative e cancro. La progressione dell'HIV è direttamente collegata all'apoptosi eccessiva e non regolata. In un individuo sano, il numero di linfociti CD4+ è in equilibrio con le cellule generate dal midollo osseo; tuttavia, nei pazienti HIV positivi, questo equilibrio viene perso a causa dell'incapacità del midollo osseo di rigenerare le cellule CD4+. Nel caso dell'HIV, i linfociti CD4+ muoiono a un ritmo accelerato per apoptosi incontrollata, se stimolati. A livello molecolare, l'apoptosi iperattiva può essere causata da difetti nelle vie di segnalazione che regolano le proteine ​​della famiglia Bcl-2. L'aumentata espressione di proteine ​​apoptotiche come il BIM, o la loro ridotta proteolisi, porta alla morte cellulare e può causare una serie di patologie, a seconda delle cellule in cui si verifica un'eccessiva attività del BIM. Le cellule tumorali possono sfuggire all'apoptosi attraverso meccanismi che sopprimono l'espressione del BIM o tramite una maggiore proteolisi del BIM.

Trattamenti

Trattamenti volti a inibire i lavori per bloccare specifiche caspasi. Infine, la proteina chinasi Akt promuove la sopravvivenza cellulare attraverso due vie. Akt fosforila e inibisce Bad (un membro della famiglia Bcl-2), causando l'interazione di Bad con lo scaffold 14-3-3 , con conseguente dissociazione di Bcl e quindi sopravvivenza cellulare. Akt attiva anche IKKα, che porta all'attivazione di NF-κB e alla sopravvivenza cellulare. L'NF-kB attivo induce l'espressione di geni anti-apoptotici come Bcl-2, con conseguente inibizione dell'apoptosi. È stato scoperto che NF-κB svolge sia un ruolo antiapoptotico che un ruolo proapoptotico a seconda degli stimoli utilizzati e del tipo di cellula.

Progressione dell'HIV

La progressione dell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana in AIDS è dovuta principalmente all'esaurimento dei linfociti T-helper CD4+ in un modo troppo rapido perché il midollo osseo del corpo possa ricostituire le cellule, portando a un sistema immunitario compromesso. Uno dei meccanismi con cui le cellule T-helper vengono esaurite è l'apoptosi, che deriva da una serie di percorsi biochimici:

  1. Gli enzimi dell'HIV disattivano l'anti-apoptotico Bcl-2 . Ciò non provoca direttamente la morte cellulare, ma prepara la cellula all'apoptosi se viene ricevuto il segnale appropriato. In parallelo, questi enzimi attivano la procaspasi-8 proapoptotica , che attiva direttamente gli eventi mitocondriali dell'apoptosi.
  2. L'HIV può aumentare il livello delle proteine ​​cellulari che provocano l'apoptosi mediata da Fas.
  3. Le proteine ​​dell'HIV riducono la quantità di marker glicoproteico CD4 presente sulla membrana cellulare.
  4. Le particelle virali e le proteine ​​​​presenti nel fluido extracellulare rilasciate sono in grado di indurre l'apoptosi nelle cellule T helper "astanti" vicine.
  5. L'HIV riduce la produzione di molecole coinvolte nella marcatura della cellula per l'apoptosi, dando al virus il tempo di replicarsi e continuare a rilasciare agenti apoptotici e virioni nel tessuto circostante.
  6. La cellula CD4+ infetta può anche ricevere il segnale di morte da una cellula T citotossica.

Le cellule possono anche morire come conseguenza diretta delle infezioni virali. L'espressione dell'HIV-1 induce l'arresto e l'apoptosi delle cellule tubulari G2/M. La progressione dall'HIV all'AIDS non è immediata e nemmeno necessariamente rapida; L'attività citotossica dell'HIV verso i linfociti CD4+ è classificata come AIDS una volta che la conta delle cellule CD4+ di un dato paziente scende al di sotto di 200.

I ricercatori dell'Università di Kumamoto in Giappone hanno sviluppato un nuovo metodo per sradicare l'HIV nelle cellule del serbatoio virale, chiamato "Lock-in e apoptosi". Usando il composto sintetizzato Heptanoylphosphatidyl L-Inositol Pentakisphophate (o L-Hippo) per legarsi fortemente alla proteina dell'HIV PR55Gag, sono stati in grado di sopprimere il germogliamento virale. Sopprimendo il germogliamento virale, i ricercatori sono stati in grado di intrappolare il virus HIV nella cellula e consentire alla cellula di subire l'apoptosi (morte cellulare naturale). Il Professore Associato Mikako Fujita ha dichiarato che l'approccio non è ancora disponibile per i pazienti HIV perché il team di ricerca deve condurre ulteriori ricerche sulla combinazione della terapia farmacologica attualmente esistente con questo approccio "Lock-in e apoptosi" per portare alla completa guarigione dall'HIV .

Infezione virale

L'induzione virale dell'apoptosi si verifica quando una o più cellule di un organismo vivente vengono infettate da un virus , portando alla morte cellulare. La morte cellulare negli organismi è necessaria per il normale sviluppo delle cellule e la maturazione del ciclo cellulare. È anche importante per mantenere le normali funzioni e attività delle cellule.

I virus possono innescare l'apoptosi delle cellule infette attraverso una serie di meccanismi tra cui:

  • Legame del recettore
  • Attivazione della proteina chinasi R (PKR)
  • Interazione con p53
  • Espressione di proteine ​​virali accoppiate a proteine ​​MHC sulla superficie della cellula infetta, permettendo il riconoscimento da parte di cellule del sistema immunitario (come Natural Killer e cellule T citotossiche ) che poi inducono la cellula infetta a subire l'apoptosi.

È noto che il virus del cimurro canino (CDV) causa apoptosi nel sistema nervoso centrale e nel tessuto linfoide dei cani infetti in vivo e in vitro. L'apoptosi causata da CDV è tipicamente indotta attraverso la via estrinseca , che attiva le caspasi che interrompono la funzione cellulare e alla fine portano alla morte delle cellule. Nelle cellule normali, CDV attiva prima la caspasi-8, che funziona come proteina iniziatrice seguita dalla proteina esecutrice caspasi-3. Tuttavia, l'apoptosi indotta da CDV nelle cellule HeLa non coinvolge la proteina iniziatrice caspasi-8. L'apoptosi delle cellule HeLa causata da CDV segue un meccanismo diverso da quello delle linee cellulari vero. Questo cambiamento nella cascata delle caspasi suggerisce che CDV induce l'apoptosi attraverso la via intrinseca , escludendo la necessità dell'iniziatore caspasi-8. La proteina carnefice è invece attivata dagli stimoli interni causati dall'infezione virale e non da una cascata di caspasi.

Il virus Oropouche (OROV) si trova nella famiglia Bunyaviridae . Lo studio dell'apoptosi indotto da Bunyaviridae è stato avviato nel 1996, quando è stato osservato che l'apoptosi è stata indotta dal virus La Crosse nelle cellule renali dei piccoli di criceto e nel cervello dei piccoli di topo.

L'OROV è una malattia trasmessa tra gli esseri umani dal moscerino mordace ( Culicoides paraensis ). È indicato come un arbovirus zoonotico e causa malattie febbrili, caratterizzate dall'insorgenza di una febbre improvvisa nota come febbre di Oropouche.

Il virus Oropouche provoca anche la distruzione delle cellule in coltura, cellule coltivate in condizioni distinte e specifiche. Un esempio di ciò può essere visto nelle cellule HeLa , per cui le cellule iniziano a degenerare poco dopo essere state infettate.

Con l'uso dell'elettroforesi su gel , si può osservare che OROV provoca la frammentazione del DNA nelle cellule HeLa. Può essere interpretato contando, misurando e analizzando le cellule della popolazione cellulare Sub/G1. Quando le cellule HeLA sono infettate con OROV, il citocromo C viene rilasciato dalla membrana dei mitocondri, nel citosol delle cellule. Questo tipo di interazione mostra che l'apoptosi viene attivata tramite una via intrinseca.

Affinché l'apoptosi si verifichi all'interno di OROV, è necessaria la rimozione del rivestimento virale, l'internalizzazione virale e la replicazione delle cellule. L'apoptosi in alcuni virus è attivata da stimoli extracellulari. Tuttavia, studi hanno dimostrato che l'infezione da OROV provoca l'attivazione dell'apoptosi attraverso stimoli intracellulari e coinvolge i mitocondri.

Molti virus codificano per proteine ​​che possono inibire l'apoptosi. Diversi virus codificano per omologhi virali di Bcl-2. Questi omologhi possono inibire le proteine ​​proapoptotiche come BAX e BAK, che sono essenziali per l'attivazione dell'apoptosi. Esempi di virali Bcl-2 proteine includono il virus di Epstein-Barr proteine BHRF1 e l' adenovirus proteina E1B 19K. Alcuni virus esprimono inibitori della caspasi che inibiscono l'attività della caspasi e un esempio è la proteina CrmA dei virus del vaiolo bovino. Mentre un certo numero di virus può bloccare gli effetti di TNF e Fas. Ad esempio, la proteina M-T2 dei virus del mixoma può legare il TNF impedendogli di legarsi al recettore del TNF e indurre una risposta. Inoltre, molti virus esprimono inibitori di p53 che possono legare p53 e inibire la sua attività di transattivazione trascrizionale. Di conseguenza, p53 non può indurre apoptosi, poiché non può indurre l'espressione di proteine ​​proapoptotiche. La proteina dell'adenovirus E1B-55K e la proteina HBx del virus dell'epatite B sono esempi di proteine ​​virali che possono svolgere tale funzione.

I virus possono rimanere intatti dall'apoptosi in particolare nelle ultime fasi dell'infezione. Possono essere esportati nei corpi apoptotici che si staccano dalla superficie della cellula morente e il fatto che siano inghiottiti dai fagociti impedisce l'inizio di una risposta dell'ospite. Questo favorisce la diffusione del virus.

Impianti

La morte cellulare programmata nelle piante ha una serie di somiglianze molecolari con quella dell'apoptosi animale, ma presenta anche differenze, tra cui spiccano la presenza di una parete cellulare e la mancanza di un sistema immunitario che rimuove i pezzi della cellula morta. Invece di una risposta immunitaria, la cellula morente sintetizza sostanze per abbattersi e le pone in un vacuolo che si rompe quando la cellula muore. Non è chiaro se l'intero processo assomigli all'apoptosi animale abbastanza da giustificare l'uso del nome apoptosi (al contrario della più generale morte cellulare programmata ).

Apoptosi indipendente dalla caspasi

La caratterizzazione delle caspasi ha permesso lo sviluppo di inibitori delle caspasi, che possono essere utilizzati per determinare se un processo cellulare coinvolge caspasi attive. Utilizzando questi inibitori è stato scoperto che le cellule possono morire mentre mostrano una morfologia simile all'apoptosi senza l'attivazione della caspasi. Studi successivi hanno collegato questo fenomeno al rilascio di AIF ( fattore che induce l'apoptosi ) dai mitocondri e alla sua traslocazione nel nucleo mediata dal suo NLS (segnale di localizzazione nucleare). All'interno dei mitocondri, l'AIF è ancorato alla membrana interna. Per essere rilasciata, la proteina viene scissa da una proteasi della calpaina calcio-dipendente .

Guarda anche

Note esplicative

citazioni

Bibliografia generale

  • Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P (2015). Biologia molecolare della cellula (6a ed.). Scienza della ghirlanda. P. 2. ISBN 978-0815344322.

link esterno