Microscopia confocale - Confocal microscopy

Microscopia confocale
Maglia D018613
Codice OPS-301 3-301
Principio di funzionamento dei microscopi a fluorescenza e confocali

La microscopia confocale , più frequentemente la microscopia confocale a scansione laser ( CLSM ) o la microscopia a scansione laser confocale ( LCSM ), è una tecnica di imaging ottico per aumentare la risoluzione ottica e il contrasto di una micrografia mediante l'utilizzo di un foro stenopeico spaziale per bloccare la luce fuori fuoco nella formazione dell'immagine. L'acquisizione di più immagini bidimensionali a diverse profondità in un campione consente la ricostruzione di strutture tridimensionali (un processo noto come sezionamento ottico ) all'interno di un oggetto. Questa tecnica è ampiamente utilizzata nelle comunità scientifiche e industriali e le applicazioni tipiche sono nelle scienze della vita , nell'ispezione dei semiconduttori e nella scienza dei materiali .

La luce viaggia attraverso il campione sotto un microscopio convenzionale il più lontano possibile nel campione, mentre un microscopio confocale focalizza solo un raggio di luce più piccolo a un livello di profondità ristretto alla volta. Il CLSM raggiunge una profondità di campo controllata e molto limitata.

Concetto di base

Principio del sensore del punto confocale dal brevetto di Minsky
La proteina di fusione GFP è espressa in Nicotiana benthamiana . La fluorescenza è visibile al microscopio confocale.

Il principio dell'imaging confocale è stato brevettato nel 1957 da Marvin Minsky e mira a superare alcune limitazioni dei tradizionali microscopi a fluorescenza ad ampio campo . In un microscopio a fluorescenza convenzionale (cioè a campo ampio) , l'intero campione viene inondato uniformemente di luce da una sorgente luminosa. Tutte le parti del campione possono essere eccitate contemporaneamente e la fluorescenza risultante viene rilevata dal fotorilevatore o dalla fotocamera del microscopio, inclusa una grande parte di sfondo sfocata. Al contrario, un microscopio confocale utilizza l'illuminazione puntiforme (vedi Funzione di diffusione del punto ) e un foro stenopeico in un piano otticamente coniugato davanti al rivelatore per eliminare il segnale fuori fuoco - il nome "confocale" deriva da questa configurazione. Poiché è possibile rilevare solo la luce prodotta dalla fluorescenza molto vicina al piano focale , la risoluzione ottica dell'immagine , in particolare nella direzione della profondità del campione, è molto migliore di quella dei microscopi a campo ampio. Tuttavia, poiché gran parte della luce proveniente dalla fluorescenza del campione è bloccata nel foro stenopeico, questa maggiore risoluzione va a scapito di una diminuzione dell'intensità del segnale, quindi spesso sono necessarie lunghe esposizioni . Per compensare questa caduta di segnale dopo il foro stenopeico , l'intensità della luce viene rilevata da un rivelatore sensibile, solitamente un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un fotodiodo a valanga , che trasforma il segnale luminoso in uno elettrico.

Poiché viene illuminato un solo punto del campione alla volta, l'imaging 2D o 3D richiede la scansione su un raster regolare (ovvero uno schema rettangolare di linee di scansione parallele) nel campione. Il raggio viene scansionato attraverso il campione nel piano orizzontale utilizzando uno o più specchi oscillanti ( serviti ). Questo metodo di scansione ha solitamente una bassa latenza di reazione e la velocità di scansione può essere variata. Le scansioni più lente forniscono un migliore rapporto segnale-rumore , con conseguente migliore contrasto .

Lo spessore ottenibile del piano focale è definito principalmente dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata divisa per l' apertura numerica della lente dell'obiettivo , ma anche dalle proprietà ottiche del campione. Il sottile sezionamento ottico possibile rende questi tipi di microscopi particolarmente adatti all'imaging 3D e alla profilazione della superficie dei campioni.

Le sezioni successive costituiscono uno "z-stack", che può essere elaborato per creare un'immagine 3D o unito in uno stack 2D (prevalentemente viene presa l'intensità massima dei pixel, altri metodi comuni includono l'utilizzo della deviazione standard o la somma dei pixel).

La microscopia confocale fornisce la capacità di sezionamento ottico diretto, non invasivo e seriale di campioni intatti, spessi e viventi con una preparazione minima del campione e un miglioramento marginale della risoluzione laterale rispetto alla microscopia a campo ampio. I campioni biologici sono spesso trattati con coloranti fluorescenti per rendere visibili gli oggetti selezionati. Tuttavia, la concentrazione effettiva del colorante può essere bassa per ridurre al minimo il disturbo dei sistemi biologici: alcuni strumenti possono tracciare singole molecole fluorescenti. Inoltre, le tecniche transgeniche possono creare organismi che producono le proprie molecole chimeriche fluorescenti (come una fusione di GFP, proteina fluorescente verde con la proteina di interesse). I microscopi confocali funzionano secondo il principio dell'eccitazione puntiforme nel campione (punto limitato dalla diffrazione) e del rilevamento puntuale del segnale fluorescente risultante. Un foro stenopeico sul rivelatore fornisce una barriera fisica che blocca la fluorescenza sfocata. Viene registrato solo il punto a fuoco o centrale del disco di Airy .

Tecniche utilizzate per la scansione orizzontale

Questa proiezione di più immagini confocali, scattate presso la struttura di microscopia ottica EMBL , mostra un gruppo di diatomee con pareti cellulari ciano, cloroplasti rossi, DNA blu e membrane e organelli verdi

In commercio sono disponibili quattro tipi di microscopi confocali:

I microscopi a scansione laser confocale utilizzano più specchi (tipicamente 2 o 3 che scansionano linearmente lungo gli assi x e y) per scansionare il laser attraverso il campione e "descansionare" l'immagine attraverso un foro stenopeico fisso e un rilevatore. Questo processo è solitamente lento e non funziona per l'imaging dal vivo, ma può essere utile per creare immagini rappresentative ad alta risoluzione di campioni fissi .

I microscopi confocali a disco rotante ( disco di Nipkow ) utilizzano una serie di fori di spillo mobili su un disco per scansionare punti di luce. Poiché una serie di fori stenopeici scansiona un'area in parallelo, ogni foro stenopeico può librarsi su un'area specifica per un periodo di tempo più lungo, riducendo così l'energia di eccitazione necessaria per illuminare un campione rispetto ai microscopi a scansione laser. La diminuzione dell'energia di eccitazione riduce la fototossicità e il fotosbiancamento di un campione, rendendolo spesso il sistema preferito per l'imaging di cellule o organismi vivi.

I microscopi confocali a microlenti potenziati o a doppio disco rotante funzionano secondo gli stessi principi dei microscopi confocali a disco rotante, tranne per il fatto che un secondo disco rotante contenente microlenti viene posizionato prima del disco rotante contenente i fori. Ogni foro stenopeico ha una microlente associata. Le microlenti agiscono per catturare un'ampia banda di luce e focalizzarla in ciascun foro stenopeico aumentando significativamente la quantità di luce diretta in ciascun foro stenopeico e riducendo la quantità di luce bloccata dal disco rotante. I microscopi confocali potenziati con microlenti sono quindi significativamente più sensibili dei sistemi a disco rotante standard. Yokogawa Electric ha inventato questa tecnologia nel 1992.

I microscopi ad array programmabili (PAM) utilizzano un modulatore di luce spaziale (SLM) controllato elettronicamente che produce una serie di fori di spillo in movimento. Lo SLM è un dispositivo contenente un array di pixel con alcune proprietà ( opacità , riflettività o rotazione ottica ) dei singoli pixel che possono essere regolate elettronicamente. L'SLM contiene specchi microelettromeccanici o componenti a cristalli liquidi . L'immagine viene solitamente acquisita da una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD).

Ognuna di queste classi di microscopi confocali presenta particolari vantaggi e svantaggi. La maggior parte dei sistemi è ottimizzata per la velocità di registrazione (ad es. acquisizione video) o per un'elevata risoluzione spaziale. I microscopi a scansione laser confocale possono avere una densità di campionamento programmabile e risoluzioni molto elevate, mentre Nipkow e PAM utilizzano una densità di campionamento fissa definita dalla risoluzione della telecamera. I frame rate di imaging sono in genere più lenti per i sistemi di scansione laser a punto singolo rispetto ai sistemi a disco rotante o PAM. I microscopi confocali a disco rotante commerciali raggiungono frame rate di oltre 50 al secondo, una caratteristica desiderabile per osservazioni dinamiche come l'imaging di cellule vive.

In pratica, Nipkow e PAM consentono più pinhole che scansionano la stessa area in parallelo purché i pinhole siano sufficientemente distanti.

Lo sviluppo all'avanguardia della microscopia a scansione laser confocale ora consente un'imaging a velocità video migliore rispetto allo standard (60 fotogrammi al secondo) utilizzando più specchi di scansione microelettromeccanici.

L' imaging a fluorescenza a raggi X confocale è una tecnica più recente che consente il controllo della profondità, oltre al puntamento orizzontale e verticale, ad esempio, durante l'analisi di strati sepolti in un dipinto.

Miglioramento della risoluzione

Il CLSM è una tecnica di imaging a scansione in cui la risoluzione ottenuta si spiega meglio confrontandola con un'altra tecnica di scansione come quella del microscopio elettronico a scansione (SEM). CLSM ha il vantaggio di non richiedere che una sonda sia sospesa a nanometri dalla superficie, come in un AFM o STM , ad esempio, dove l'immagine è ottenuta scansionando con una punta fine su una superficie. La distanza dalla lente dell'obiettivo alla superficie (chiamata distanza di lavoro ) è tipicamente paragonabile a quella di un microscopio ottico convenzionale. Varia con il design ottico del sistema, ma sono tipiche distanze di lavoro da centinaia di micrometri a diversi millimetri.

In CLSM un campione è illuminato da una sorgente laser puntiforme e ciascun elemento di volume è associato a una discreta diffusione o intensità di fluorescenza. Qui, la dimensione del volume di scansione è determinata dalla dimensione del punto (vicino al limite di diffrazione ) del sistema ottico perché l'immagine del laser di scansione non è un punto infinitamente piccolo ma un modello di diffrazione tridimensionale. La dimensione di questo modello di diffrazione e il volume focale che definisce sono controllati dall'apertura numerica della lente dell'obiettivo del sistema e dalla lunghezza d'onda del laser utilizzato. Questo può essere visto come il limite di risoluzione classico dei microscopi ottici convenzionali che utilizzano l'illuminazione ad ampio campo. Tuttavia, con la microscopia confocale è anche possibile migliorare il limite di risoluzione delle tecniche di illuminazione ad ampio campo poiché l'apertura confocale può essere chiusa per eliminare ordini superiori del modello di diffrazione. Ad esempio, se il diametro del foro stenopeico è impostato su 1 unità Airy, solo il primo ordine del modello di diffrazione passa attraverso l'apertura al rivelatore mentre gli ordini superiori sono bloccati, migliorando così la risoluzione al costo di una leggera diminuzione della luminosità. Nelle osservazioni in fluorescenza, il limite di risoluzione della microscopia confocale è spesso limitato dal rapporto segnale/rumore causato dal piccolo numero di fotoni tipicamente disponibili nella microscopia a fluorescenza. Si può compensare questo effetto utilizzando fotorivelatori più sensibili o aumentando l'intensità della sorgente del punto laser illuminante. Aumentando l'intensità dell'illuminazione laser si rischia uno sbiancamento eccessivo o altri danni al campione di interesse, soprattutto per gli esperimenti in cui è richiesto il confronto della luminosità della fluorescenza. Durante l'imaging di tessuti con rifrazione differenziale, come il mesofillo spugnoso delle foglie delle piante o altri tessuti contenenti spazio aereo, sono spesso pronunciate aberrazioni sferiche che compromettono la qualità dell'immagine confocale. Tali aberrazioni, tuttavia, possono essere significativamente ridotte montando campioni in perfluorocarburi otticamente trasparenti e non tossici come la perfluorodecalina , che si infiltra facilmente nei tessuti e ha un indice di rifrazione quasi identico a quello dell'acqua.

Usi

Il CLSM è ampiamente utilizzato in varie discipline delle scienze biologiche , dalla biologia cellulare e genetica alla microbiologia e alla biologia dello sviluppo . Viene anche utilizzato nell'ottica quantistica, nell'imaging e nella spettroscopia di nanocristalli.

Biologia e medicina

Esempio di una pila di immagini al microscopio confocale che mostrano la distribuzione dei filamenti di actina in una cellula.

Clinicamente, il CLSM viene utilizzato nella valutazione di varie malattie dell'occhio ed è particolarmente utile per l'imaging, l'analisi qualitativa e la quantificazione delle cellule endoteliali della cornea . Viene utilizzato per localizzare e identificare la presenza di elementi fungini filamentosi nello stroma corneale in caso di cheratomicosi , consentendo una rapida diagnosi e quindi l'istituzione precoce della terapia definitiva. Anche la ricerca sulle tecniche CLSM per le procedure endoscopiche ( endomicroscopia ) si sta rivelando promettente. Nell'industria farmaceutica, si raccomandava di seguire il processo di fabbricazione delle forme farmaceutiche a film sottile, per controllare la qualità e l'uniformità della distribuzione dei farmaci. La microscopia confocale viene anche utilizzata per studiare i biofilm , complesse strutture porose che sono l'habitat preferito dei microrganismi. Alcune delle funzioni temporali e spaziali dei biofilm possono essere comprese solo studiando la loro struttura su micro e meso scale. Lo studio della microscala è necessario per rilevare l'attività e l'organizzazione dei singoli microrganismi.

Ottica e cristallografia

CLSM è utilizzato come meccanismo di recupero dati in alcuni sistemi di archiviazione dati ottici 3D e ha contribuito a determinare l'età del papiro di Magdalen .

Conservazione dell'audio

Il sistema IRENE utilizza la microscopia confocale per la scansione ottica e il recupero dell'audio storico danneggiato.

Varianti e miglioramenti

Miglioramento della risoluzione assiale

La funzione di diffusione del punto del foro stenopeico è un ellissoide, più volte lungo quanto largo. Ciò limita la risoluzione assiale del microscopio. Una tecnica per superare questo problema è la microscopia 4Pi in cui la luce incidente e/o emessa può interferire sia da sopra che da sotto il campione per ridurre il volume dell'ellissoide. Una tecnica alternativa è la microscopia theta confocale . In questa tecnica il cono di luce illuminante e la luce rilevata sono inclinati l'uno rispetto all'altro (risultati migliori quando sono perpendicolari). L'intersezione delle due funzioni di diffusione puntuale fornisce un volume di campione effettivo molto più piccolo. Da questo si è evoluto il microscopio a illuminazione a piano singolo . Inoltre, la deconvoluzione può essere impiegata utilizzando una funzione di diffusione del punto derivata sperimentalmente per rimuovere la luce fuori fuoco, migliorando il contrasto sia nel piano assiale che in quello laterale.

Super risoluzione

Esistono varianti confocali che raggiungono una risoluzione al di sotto del limite di diffrazione come la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED). Oltre a questa tecnica è disponibile un'ampia varietà di altre tecniche di super-risoluzione (non basate sul confocale) come PALM, (d)STORM, SIM e così via. Hanno tutti i loro vantaggi come la facilità d'uso, la risoluzione e la necessità di attrezzature speciali, tamponi o fluorofori.

Operabilità a bassa temperatura

Per l'immagine di campioni a basse temperature, sono stati utilizzati due approcci principali, entrambi basati sull'architettura della microscopia confocale a scansione laser . Un approccio è quello di utilizzare un criostato a flusso continuo : solo il campione è a bassa temperatura ed è indirizzato otticamente attraverso una finestra trasparente. Un altro possibile approccio è quello di avere parte dell'ottica (in particolare l'obiettivo del microscopio) in un dewar di stoccaggio criogenico . Questo secondo approccio, sebbene più ingombrante, garantisce una migliore stabilità meccanica ed evita le perdite dovute al serramento.

immagini

Storia

Gli inizi: 1940-1957

Schema della domanda di brevetto di Minsky che mostra il principio del microscopio a scansione confocale a trasmissione da lui costruito.

Nel 1940 Hans Goldmann, oculista a Berna , in Svizzera, sviluppò un sistema di lampade a fessura per documentare gli esami oculistici. Questo sistema è considerato da alcuni autori successivi come il primo sistema ottico confocale.

Nel 1943 Zyun Koana pubblicò un sistema confocale. Una figura in questa pubblicazione mostra un percorso del raggio di trasmissione confocale.

Nel 1951 Hiroto Naora, un collega di Koana, descrisse un microscopio confocale sulla rivista Science for Spectrophotometry .

Il primo microscopio a scansione confocale è stato costruito da Marvin Minsky nel 1955 e nel 1957 è stato depositato un brevetto. La scansione del punto di illuminazione nel piano focale è stata ottenuta spostando il tavolino. Nessuna pubblicazione scientifica è stata presentata e nessuna immagine realizzata con essa è stata conservata.

Il microscopio a scansione tandem

Schema del microscopio a scansione tandem di Petráň. Barra rossa aggiunta per indicare il Nipkow-Disk.

Nel 1960, il cecoslovacco Mojmír Petráň dalla Facoltà di Medicina della Università Carlo nella Plzeň ha sviluppato il Tandem-scansione-microscopio, il microscopio confocale prima commercializzato. È stato venduto da una piccola azienda in Cecoslovacchia e negli Stati Uniti da Tracor-Northern (in seguito Noran) e ha utilizzato un disco Nipkow rotante per generare più fori di eccitazione ed emissione.

Il brevetto cecoslovacco è stato depositato nel 1966 da Petráň e Milan Hadravský, un collega cecoslovacco. Una prima pubblicazione scientifica con dati e immagini generate con questo microscopio è stata pubblicata sulla rivista Science nel 1967, a cura di M. David Egger dell'Università di Yale e Petráň. Come nota in calce a questo articolo viene menzionato che Petráň progettò il microscopio e ne supervisionò la costruzione e che era, in parte, un "associato di ricerca" a Yale. Una seconda pubblicazione del 1968 descriveva la teoria e i dettagli tecnici dello strumento e aveva Hadravský e Robert Galambos , il capo del gruppo a Yale, come autori aggiuntivi. Nel 1970 viene concesso il brevetto statunitense. È stato depositato nel 1967.

1969: Il primo microscopio confocale a scansione laser

Nel 1969 e nel 1971, M. David Egger e Paul Davidovits della Yale University , pubblicarono due articoli che descrivevano il primo microscopio confocale a scansione laser . Era uno scanner a punti, il che significa che è stato generato un solo punto di illuminazione. Ha usato la microscopia a riflessione dell'epi-illuminazione per l'osservazione del tessuto nervoso. Un laser a elio-neon da 5 mW con luce a 633 nm è stato riflesso da uno specchio semitrasparente verso l'obiettivo. L'obiettivo era un semplice obiettivo con una lunghezza focale di 8,5 mm. A differenza di tutti i sistemi precedenti e successivi, il campione è stato scansionato dal movimento di questa lente (scansione oggettiva), portando a un movimento del punto focale. La luce riflessa è tornata allo specchio semitrasparente, la parte trasmessa è stata focalizzata da un'altra lente sul foro di rilevamento dietro il quale è stato posizionato un tubo fotomoltiplicatore. Il segnale è stato visualizzato da un CRT di un oscilloscopio, il raggio catodico è stato mosso contemporaneamente all'obiettivo. Un dispositivo speciale ha permesso di realizzare foto Polaroid , tre delle quali sono state mostrate nella pubblicazione del 1971.

Gli autori speculano sui coloranti fluorescenti per le indagini in vivo . Citano il brevetto di Minsky, ringraziano Steve Baer, ​​all'epoca studente di dottorato presso la Albert Einstein School of Medicine di New York, dove sviluppò un microscopio a scansione confocale, per aver suggerito di utilizzare un laser con il "microscopio di Minsky" e ringraziano Galambos, Hadravsky e Petráň per le discussioni che hanno portato allo sviluppo del loro microscopio. La motivazione per il loro sviluppo era che nel microscopio a scansione tandem solo una frazione di 10 -7 della luce di illuminazione partecipa alla generazione dell'immagine nell'oculare. Pertanto, la qualità dell'immagine non era sufficiente per la maggior parte delle indagini biologiche.

1977-1985: scanner a punti con laser e scansione del palco

Nel 1977 Colin JR Sheppard e Amarjyoti Choudhury , Oxford , Regno Unito, pubblicarono un'analisi teorica dei microscopi confocali ea scansione laser. È probabilmente la prima pubblicazione che utilizza il termine "microscopio confocale".

Nel 1978, i fratelli Christoph Cremer e Thomas Cremer pubblicarono un progetto per un microscopio confocale a scansione laser utilizzando eccitazione fluorescente con autofocus elettronico. Hanno anche suggerito un'illuminazione del punto laser utilizzando un " ologramma a 4 punti ". Questo progetto CLSM ha combinato per la prima volta il metodo di scansione laser con il rilevamento 3D di oggetti biologici etichettati con marcatori fluorescenti .

Nel 1978 e nel 1980, il gruppo di Oxford intorno a Colin Sheppard e Tony Wilson descrisse come rivelatori un microscopio confocale con illuminazione epi-laser, stage scanning e tubi fotomoltiplicatori . Lo stadio potrebbe muoversi lungo l'asse ottico (asse z), consentendo sezioni seriali ottiche.

Nel 1979 Fred Brakenhoff e collaboratori hanno dimostrato che i vantaggi teorici del sezionamento ottico e del miglioramento della risoluzione sono effettivamente realizzabili nella pratica. Nel 1985 questo gruppo è stato il primo a pubblicare immagini convincenti scattate al microscopio confocale in grado di rispondere a domande biologiche. Poco dopo molti altri gruppi hanno iniziato a utilizzare la microscopia confocale per rispondere a domande scientifiche che fino ad allora erano rimaste un mistero a causa dei limiti tecnologici.

Nel 1983 IJ Cox e C. Sheppard di Oxford pubblicarono il primo lavoro in cui un microscopio confocale era controllato da un computer. Il primo microscopio a scansione laser commerciale, lo stage-scanner SOM-25 è stato offerto da Oxford Optoelectronics (dopo diverse acquisizioni acquisite da BioRad) a partire dal 1982. Era basato sul design del gruppo di Oxford.

A partire dal 1985: Scanner a punti laser con scansione a raggio

A metà degli anni '80, William Bradshaw Amos e John Graham White e colleghi del Laboratorio di Biologia Molecolare di Cambridge costruirono il primo microscopio a scansione confocale. Il palco con il campione non si muoveva, invece lo era il punto di illuminazione, consentendo un'acquisizione dell'immagine più rapida: quattro immagini al secondo con 512 linee ciascuna. Immagini intermedie enormemente ingrandite, a causa di un percorso del raggio lungo 1-2 metri, hanno permesso l'uso di un diaframma a iride convenzionale come "foro stenopeico", con diametri ~ 1 mm. Le prime microfotografie sono state scattate con un'esposizione a lungo termine su pellicola prima che venisse aggiunta una fotocamera digitale. Un ulteriore miglioramento ha permesso di ingrandire per la prima volta la preparazione. Zeiss , Leitz e Cambridge Instruments non avevano alcun interesse in una produzione commerciale. Il Medical Research Council (MRC) ha infine sponsorizzato lo sviluppo di un prototipo. Il progetto è stato acquisito da Bio-Rad , modificato con il controllo del computer e commercializzato come "MRC 500". Il successore MRC 600 fu in seguito la base per lo sviluppo del primo microscopio fluorescente a due fotoni sviluppato nel 1990 alla Cornell University .

Gli sviluppi al KTH Royal Institute of Technology di Stoccolma nello stesso periodo hanno portato a un CLSM commerciale distribuito dalla società svedese Sarastro. L'impresa è stata acquisita nel 1990 da Molecular Dynamics, ma alla fine il CLSM è stato interrotto. In Germania, Heidelberg Instruments , fondata nel 1984, ha sviluppato un CLSM, inizialmente pensato per applicazioni industriali piuttosto che per la biologia. Questo strumento è stato rilevato nel 1990 da Leica Lasertechnik . Zeiss aveva già sul mercato un microscopio a scansione laser a punto volante non confocale che è stato aggiornato a un confocale. Un rapporto del 1990 citava alcuni produttori di confocali: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern e Zeiss.

Nel 1989, Fritz Karl Preikschat , con il figlio Ekhard Preikschat, ha inventato il microscopio a diodo laser a scansione per l'analisi della dimensione delle particelle. Lui e Ekhard Preikschat hanno co-fondato Lasentec per commercializzarlo. Nel 2001, Lasentic è stata acquisita da Mettler Toledo . Sono utilizzati principalmente nell'industria farmaceutica per fornire il controllo in situ del processo di cristallizzazione in grandi sistemi di purificazione.

Guarda anche

  • Microscopia a eccitazione a due fotoni : sebbene utilizzino una tecnologia correlata (entrambi sono microscopi a scansione laser), i microscopi a fluorescenza multifotone non sono microscopi strettamente confocali. Il termine confocale deriva dalla presenza di un diaframma nel piano focale coniugato (confocale). Questo diaframma è solitamente assente nei microscopi multifotoni.

Riferimenti

link esterno