Riparazione del disadattamento del DNA - DNA mismatch repair

Diagramma dei percorsi di riparazione del disadattamento del DNA. La prima colonna rappresenta la riparazione del disallineamento negli eucarioti, mentre la seconda rappresenta la riparazione nella maggior parte dei batteri. La terza colonna mostra la riparazione del disadattamento, per essere specifici in E. coli .
Micrografia mostra la perdita di colorazione per MLH1 in adenocarcinoma colorettale in linea con DNA mismatch repair (sinistra dell'immagine) e mucosa colorettale benigna (destra dell'immagine).

La riparazione del mismatch del DNA ( MMR ) è un sistema per riconoscere e riparare l'inserimento, la cancellazione e l'errata incorporazione di basi che possono sorgere durante la replicazione e la ricombinazione del DNA , oltre a riparare alcune forme di danno al DNA .

La riparazione del disadattamento è specifica per il filo. Durante la sintesi del DNA il filamento di nuova sintesi (figlia) includerà comunemente errori. Per iniziare la riparazione, il meccanismo di riparazione del disadattamento distingue il filamento appena sintetizzato dal modello (parentale). Nei batteri gram-negativi, l' emimetilazione transitoria distingue i filamenti (il genitore è metilato e la figlia no). Tuttavia, in altri procarioti ed eucarioti, l'esatto meccanismo non è chiaro. Si sospetta che, negli eucarioti, il DNA a filamento ritardato di nuova sintesi contenga transitoriamente dei nick (prima di essere sigillato dalla DNA ligasi) e fornisca un segnale che indirizza i sistemi di correzione delle bozze di mancata corrispondenza al filamento appropriato. Ciò implica che queste intaccature devono essere presenti nel filamento principale, e di recente sono state trovate prove di ciò. Lavori recenti hanno dimostrato che i nick sono siti per il caricamento dipendente da RFC del PCNA del morsetto scorrevole di replicazione, in un modo specifico per l'orientamento, in modo tale che una faccia della proteina a forma di ciambella sia giustapposta verso l'estremità 3'-OH al nick. Il PCNA caricato dirige quindi l'azione dell'endonucleasi MutLalpha al filamento figlia in presenza di un disadattamento e MutSalpha o MutSbeta.

Qualsiasi evento mutazionale che distrugga la struttura superelica del DNA porta con sé il potenziale di compromettere la stabilità genetica di una cellula. Il fatto che i sistemi di rilevamento e riparazione dei danni siano complessi quanto lo stesso meccanismo di replicazione evidenzia l'importanza che l'evoluzione ha attribuito alla fedeltà del DNA.

Esempi di basi non corrispondenti includono un accoppiamento G/T o A/C (vedi riparazione del DNA ). I disallineamenti sono comunemente dovuti alla tautomerizzazione delle basi durante la replicazione del DNA. Il danno viene riparato riconoscendo la deformità causata dal mismatch, determinando il filamento stampo e non templato, ed asportando la base incorporata erroneamente e sostituendola con il nucleotide corretto . Il processo di rimozione coinvolge più del semplice nucleotide stesso non corrispondente. Possono essere rimosse poche o fino a migliaia di coppie di basi del filamento di DNA appena sintetizzato.

Proteine ​​di riparazione del disadattamento

Proteina di riparazione del disadattamento del DNA, dominio C-terminale
PDB 1h7u EBI.jpg
hpms2-atpgs
Identificatori
Simbolo DNA_mis_repair
Pfam PF01119
Clan Pfam CL0329
InterPro IPR013507
PROSITO PDOC00057
SCOP2 1bkn / SCOPE / SUPFAM

La riparazione del disadattamento è un processo altamente conservato dai procarioti agli eucarioti . La prima prova di riparazione del disadattamento è stata ottenuta da S. pneumoniae (i geni hexA e hexB ). Il lavoro successivo su E. coli ha identificato un certo numero di geni che, quando inattivati ​​per mutazione , causano ceppi ipermutabili. I prodotti genici sono, quindi, chiamati proteine ​​"Mut" e sono i principali componenti attivi del sistema di riparazione del mismatch. Tre di queste proteine ​​sono essenziali per rilevare la mancata corrispondenza e dirigere verso di essa il meccanismo di riparazione: MutS , MutH e MutL (MutS è un omologo di HexA e MutL di HexB).

MutS forma un dimero (MutS 2 ) che riconosce la base non corrispondente sul filamento figlia e lega il DNA mutato. MutH si lega ai siti emimetilati lungo il DNA figlia, ma la sua azione è latente, essendo attivata solo al contatto da un dimero MutL (MutL 2 ), che lega il complesso MutS-DNA e funge da mediatore tra MutS 2 e MutH, attivando il quest'ultimo. Il DNA viene messo in loop per cercare il sito di metilazione d(GATC) più vicino alla mancata corrispondenza, che potrebbe trovarsi fino a 1 kb di distanza. Dopo l'attivazione da parte del complesso MutS-DNA, MutH intacca il filamento figlia vicino al sito emimetilato. MutL recluta UvrD helicase (DNA Helicase II) per separare i due filamenti con una polarità specifica da 3' a 5'. L'intero complesso MutSHL quindi scorre lungo il DNA nella direzione del disadattamento, liberando il filamento da asportare man mano che procede. Un'esonucleasi segue il complesso e digerisce la coda dell'ss-DNA. L'esonucleasi reclutata dipende da quale lato del disadattamento MutH incide il filamento – 5' o 3'. Se il nick creato da MutH si trova all'estremità 5' della mancata corrispondenza, viene utilizzata RecJ o ExoVII (entrambe esonucleasi da 5' a 3'). Se, tuttavia, il nick si trova all'estremità 3' della mancata corrispondenza, viene utilizzato ExoI (un enzima da 3' a 5').

L'intero processo termina oltre il sito di mancata corrispondenza, ovvero sia il sito stesso che i nucleotidi circostanti vengono completamente asportati. Il gap a singolo filamento creato dall'esonucleasi può quindi essere riparato dalla DNA polimerasi III (assistita dalla proteina legante il singolo filamento), che utilizza l'altro filamento come stampo, e infine sigillato dalla DNA ligasi. La DNA metilasi quindi metila rapidamente il filamento figlia.

Omologhi MutS

Quando è legato, il dimero MutS 2 piega l'elica del DNA e protegge circa 20 coppie di basi. Ha una debole attività dell'ATPasi e il legame dell'ATP porta alla formazione di strutture terziarie sulla superficie della molecola. La struttura cristallina di MutS rivela che è eccezionalmente asimmetrica e, mentre la sua conformazione attiva è un dimero, solo una delle due metà interagisce con il sito di mancata corrispondenza.

Negli eucarioti, M ut S h omologs costituiscono due importanti eterodimeri: MSH2 / MSH6 (MutSα) e MSH2 / Msh3 (MutSβ). La via MutSα è coinvolta principalmente nella sostituzione delle basi e nella riparazione del disadattamento di piccoli anelli. La via MutSβ è anche coinvolta nella riparazione di piccoli loop, oltre alla riparazione di grandi loop (~ 10 nucleotidi). Tuttavia, MutSβ non ripara le sostituzioni di base.

Omologhi MutL

MutL ha anche una debole attività dell'ATPasi (usa l'ATP per il movimento). Forma un complesso con MutS e MutH, aumentando l'impronta MutS sul DNA.

Tuttavia, la processività (la distanza che l'enzima può percorrere lungo il DNA prima di dissociarsi) di UvrD è solo ~ 40-50 bp. Poiché la distanza tra il nick creato da MutH e il disadattamento può essere in media di ~600 bp, se non c'è un altro UvrD caricato, la sezione non avvolta è libera di ricotturarsi al suo filamento complementare, costringendo il processo a ricominciare. Tuttavia, quando è assistito da MutL, la velocità di caricamento di UvrD è notevolmente aumentata. Mentre la processività (e l'utilizzo di ATP) delle singole molecole di UvrD rimane la stessa, l'effetto totale sul DNA è notevolmente potenziato; il DNA non ha alcuna possibilità di ri-ricottura, poiché ogni UvrD svolge 40-50 bp di DNA, si dissocia e quindi viene immediatamente sostituito da un altro UvrD, ripetendo il processo. Ciò espone ampie sezioni di DNA alla digestione con esonucleasi , consentendo una rapida escissione (e successiva sostituzione) del DNA errato.

Eucarioti hanno cinque M ut L h omologs designati come MLH1, MLH2, MLH3, PMS1 e PMS2. Formano eterodimeri che imitano MutL in E. coli . Gli omologhi umani del MutL procariotico formano tre complessi denominati MutLα, MutLβ e MutLγ. Il complesso MutLα è costituito da subunità MLH1 e PMS2, l'eterodimero MutLβ è costituito da MLH1 e PMS1, mentre MutLγ è costituito da MLH1 e MLH3. MutLα agisce come un'endonucleasi che introduce rotture del filamento nel filamento figlia dopo l'attivazione per disadattamento e altre proteine ​​richieste, MutSα e PCNA. Queste interruzioni del filamento fungono da punti di ingresso per un'attività di esonucleasi che rimuove il DNA non corrispondente. I ruoli interpretati da MutLβ e MutLγ nella riparazione dei disallineamenti sono meno compresi.

MutH: un'endonucleasi presente in E. coli e Salmonella

MutH è un'endonucleasi molto debole che viene attivata una volta legata a MutL (che a sua volta è legata a MutS). E 'Nicks non metilato del DNA e il filamento del DNA non metilato hemimethylated ma non nick completamente metilato del DNA. Gli esperimenti hanno dimostrato che la riparazione del disadattamento è casuale se nessuno dei due filamenti è metilato. Questi comportamenti hanno portato alla proposta che MutH determina quale filamento contiene la mancata corrispondenza. MutH non ha un omologo eucariotico. La sua funzione endonucleasica è assorbita dagli omologhi MutL, che hanno un'attività esonucleasica 5'-3' specializzata. Il bias del filamento per rimuovere i disallineamenti dal filamento figlia appena sintetizzato negli eucarioti può essere fornito dalle estremità 3' libere dei frammenti di Okazaki nel nuovo filamento creato durante la replicazione.

PCNA -morsetto scorrevole

PCNA e il morsetto scorrevole si associano rispettivamente a MutSα/β e MutS. Sebbene i rapporti iniziali suggerissero che il complesso PCNA-MutSα potesse migliorare il riconoscimento del disadattamento, è stato recentemente dimostrato che non vi è alcun cambiamento apparente nell'affinità di MutSα per un disadattamento in presenza o assenza di PCNA. Inoltre, i mutanti di MutSα che non sono in grado di interagire con il PCNA in vitro mostrano la capacità di eseguire il riconoscimento del disadattamento e l'escissione del disadattamento a livelli prossimi al tipo selvaggio. Tali mutanti sono difettosi nella reazione di riparazione diretta da una rottura del filamento 5', suggerendo per la prima volta la funzione di MutSα in una fase post-escissione della reazione.

Significato clinico

Difetti ereditati nella riparazione del disallineamento

Le mutazioni negli omologhi umani delle proteine ​​Mut influiscono sulla stabilità genomica, che può provocare instabilità dei microsatelliti (MSI), implicata in alcuni tumori umani. In particolare, i tumori colorettali ereditari non polipositici ( HNPCC o sindrome di Lynch) sono attribuiti a varianti germinali dannose nei geni che codificano rispettivamente per gli omologhi MutS e MutL MSH2 e MLH1 , che sono quindi classificati come geni oncosoppressori. Un sottotipo di HNPCC, la sindrome di Muir-Torre (MTS), è associato a tumori della pelle. Se entrambe le copie ereditate (alleli) di un gene MMR portano varianti genetiche dannose, ciò si traduce in una condizione molto rara e grave: la sindrome del cancro della riparazione del mismatch (o deficit costituzionale della riparazione del mismatch, CMMR-D), che si manifesta come occorrenze multiple di tumori a in tenera età, spesso tumori del colon e del cervello .

Silenziamento epigenetico dei geni di riparazione del mismatch

I tumori sporadici con un deficit di riparazione del DNA hanno solo raramente una mutazione in un gene di riparazione del DNA, ma tendono invece ad avere alterazioni epigenetiche come la metilazione del promotore che inibiscono l'espressione genica di riparazione del DNA. Circa il 13% dei tumori del colon-retto è carente nella riparazione del disadattamento del DNA, comunemente a causa della perdita di MLH1 (9,8%), o talvolta di MSH2, MSH6 o PMS2 (tutti ≤ 1,5%). Per la maggior parte dei tumori colorettali sporadici carenti di MLH1, la carenza era dovuta alla metilazione del promotore di MLH1. Altri tipi di cancro hanno frequenze più elevate di perdita di MLH1 (vedi tabella sotto), che sono ancora in gran parte il risultato della metilazione del promotore del gene MLH1 . Un diverso meccanismo epigenetico alla base delle carenze di MMR potrebbe comportare la sovraespressione di un microRNA, ad esempio i livelli di miR-155 sono inversamente correlati con l'espressione di MLH1 o MSH2 nel cancro del colon-retto.

Tumori carenti di MLH1
Tipo di cancro Frequenza di carenza nel cancro Frequenza di carenza nel campo adiacente difetto
Stomaco 32% 24%-28%
Stomaco (tumori di tipo foveolare) 74% 71%
Stomaco nella valle del Kashmir ad alta incidenza 73% 20%
Esofageo 73% 27%
Carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) 31%-33% 20% -25%
Carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) 69% 72%
Colorettale 10%

Guasti MMR nei difetti di campo

Un difetto di campo (cancerizzazione di campo) è un'area dell'epitelio che è stata precondizionata da cambiamenti epigenetici o genetici, predisponendola allo sviluppo del cancro. Come sottolineato da Rubin "... ci sono prove che più dell'80% delle mutazioni somatiche trovate nei tumori del colon-retto umani con fenotipo mutatore si verificano prima dell'inizio dell'espansione clonale terminale". Allo stesso modo, Vogelstein et al. sottolineare che più della metà delle mutazioni somatiche identificate nei tumori si sono verificate in una fase pre-neoplastica (in un difetto di campo), durante la crescita di cellule apparentemente normali.

Le carenze di MLH1 erano comuni nei difetti di campo (tessuti istologicamente normali) che circondavano i tumori; vedere la tabella sopra. L'MLH1 epigeneticamente silenziato o mutato probabilmente non conferirebbe un vantaggio selettivo a una cellula staminale, tuttavia, causerebbe un aumento dei tassi di mutazione e uno o più geni mutati potrebbero fornire alla cellula un vantaggio selettivo. Il gene carente MLH1 potrebbe quindi essere trasportato come gene passeggero (autostoppista) selettivamente quasi neutro quando la cellula staminale mutata genera un clone espanso. La continua presenza di un clone con un MLH1 epigeneticamente represso continuerebbe a generare ulteriori mutazioni, alcune delle quali potrebbero produrre un tumore.

Componenti MMR nell'uomo

Nell'uomo, sette proteine ​​di riparazione del disadattamento del DNA (MMR) ( MLH1 , MLH3 , MSH2 , MSH3 , MSH6 , PMS1 e PMS2 ) lavorano in modo coordinato in fasi sequenziali per avviare la riparazione dei disallineamenti del DNA. Inoltre, ci sono sottopercorsi MMR Exo1-dipendenti ed Exo1-indipendenti.

Altri prodotti genici coinvolti nella riparazione del disadattamento (successivo all'iniziazione da parte dei geni MMR) negli esseri umani includono DNA polimerasi delta , PCNA , RPA , HMGB1 , RFC e DNA ligasi I , oltre a fattori di modificazione dell'istone e della cromatina .

In determinate circostanze, la via MMR può reclutare una DNA polimerasi eta ( POLH ) soggetta a errori . Ciò accade nei linfociti B durante l'ipermutazione somatica , dove POLH viene utilizzato per introdurre la variazione genetica nei geni degli anticorpi. Tuttavia, questo percorso MMR soggetto a errori può essere attivato in altri tipi di cellule umane in seguito all'esposizione a genotossine e in effetti è ampiamente attivo in vari tumori umani, causando mutazioni che portano una firma dell'attività POLH.

MMR e frequenza di mutazione

Riconoscere e riparare i mismatch e gli indel è importante per le cellule perché in caso contrario si verifica l' instabilità dei microsatelliti (MSI) e un elevato tasso di mutazione spontanea (fenotipo mutatore). Rispetto ad altri tipi di cancro, il cancro con deficit di MMR (MSI) ha un'alta frequenza di mutazioni, simile al melanoma e al cancro del polmone, tipi di cancro causati da una forte esposizione alle radiazioni UV e sostanze chimiche mutagene.

Oltre a un carico di mutazioni molto elevato, le carenze di MMR comportano un'insolita distribuzione delle mutazioni somatiche nel genoma umano: ciò suggerisce che l'MMR protegge preferenzialmente le regioni eucromatiche a replicazione precoce, ricche di geni. Al contrario, le regioni del genoma eterocromatico a replicazione tardiva, povere di geni, mostrano alti tassi di mutazione in molti tumori umani.

La modificazione dell'istone H3K36me3 , un marchio epigenetico della cromatina attiva, ha la capacità di reclutare il complesso MSH2-MSH6 (hMutSα). Coerentemente, le regioni del genoma umano con alti livelli di H3K36me3 accumulano meno mutazioni dovute all'attività MMR.

Perdita di più vie di riparazione del DNA nei tumori

La mancanza di MMR si verifica spesso in coordinazione con la perdita di altri geni di riparazione del DNA. Ad esempio, i geni MMR MLH1 e MLH3 e altri 11 geni di riparazione del DNA (come MGMT e molti geni del percorso NER ) erano significativamente down-regolati negli astrocitomi di grado inferiore e di grado superiore, in contrasto con il normale tessuto cerebrale. Inoltre, l' espressione di MLH1 e MGMT era strettamente correlata in 135 campioni di cancro gastrico e la perdita di MLH1 e MGMT sembrava essere accelerata in modo sincrono durante la progressione del tumore.

L'espressione carente di più geni di riparazione del DNA si trova spesso nei tumori e può contribuire alle migliaia di mutazioni solitamente riscontrate nei tumori (vedi Frequenze di mutazione nei tumori ).

Invecchiamento

Un'idea popolare, che non è riuscita a ottenere un supporto sperimentale significativo, è l'idea che la mutazione, distinta dal danno al DNA, sia la causa principale dell'invecchiamento. I topi difettoso nel mutL omologo PMS2 avere attorno ad una frequenza di mutazione 100 volte elevato in tutti i tessuti, ma non sembrano invecchiare più rapidamente. Questi topi mostrano uno sviluppo e una vita per lo più normali, ad eccezione della carcinogenesi a esordio precoce e dell'infertilità maschile.

Guarda anche

Riferimenti

Ulteriori letture

link esterno