Proteina fluorescente verde - Green fluorescent protein
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 Struttura della proteina fluorescente verde Aequorea victoria .
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| Identificatori | |||||||||
| Simbolo | GFP | ||||||||
| Pfam | PF01353 | ||||||||
| Clan Pfam | CL0069 | ||||||||
| InterPro | IPR011584 | ||||||||
| CATH | 1ema | ||||||||
| SCOP2 | 1ema / SCOPE / SUPFAM | ||||||||
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| Proteina fluorescente verde | |||||||
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| Identificatori | |||||||
| Organismo | |||||||
| Simbolo | GFP | ||||||
| UniProt | P42212 | ||||||
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La proteina fluorescente verde ( GFP ) è una proteina che mostra una fluorescenza verde brillante quando esposta alla luce nella gamma dal blu all'ultravioletto . L'etichetta GFP si riferisce tradizionalmente alla proteina isolata per prima dalla medusa Aequorea victoria ed è talvolta chiamata avGFP . Tuttavia, i GFP sono stati trovati in altri organismi tra cui coralli , anemoni di mare , zoanitidi , copepodi e lancette .
La GFP di A. victoria ha un picco di eccitazione maggiore alla lunghezza d' onda di 395 nm e uno minore a 475 nm. Il suo picco di emissione è a 509 nm, che si trova nella porzione verde inferiore dello spettro visibile . La resa quantica di fluorescenza (QY) di GFP è 0,79. La GFP della viola del pensiero marina ( Renilla reniformis ) ha un unico picco di eccitazione principale a 498 nm. La GFP è uno strumento eccellente in molte forme di biologia grazie alla sua capacità di formare un cromoforo interno senza richiedere cofattori accessori , prodotti genici o enzimi / substrati diversi dall'ossigeno molecolare.
Nella biologia cellulare e molecolare , il gene GFP è spesso utilizzato come reporter di espressione . È stato utilizzato in forme modificate per realizzare biosensori e sono stati creati molti animali che esprimono GFP, il che dimostra una prova del concetto che un gene può essere espresso in un dato organismo, in organi selezionati o in cellule di interesse. La GFP può essere introdotta negli animali o in altre specie attraverso tecniche transgeniche e mantenuta nel loro genoma e in quello della loro prole. Ad oggi, la GFP è stata espressa in molte specie, inclusi batteri, lieviti, funghi, pesci e mammiferi, comprese le cellule umane. Gli scienziati Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura e Martin Chalfie hanno ricevuto il Premio Nobel 2008 per la chimica il 10 ottobre 2008 per la scoperta e lo sviluppo della proteina fluorescente verde.
La maggior parte dei geni disponibili in commercio per GFP e proteine fluorescenti simili sono lunghi circa 730 paia di basi. La proteina naturale ha 238 aminoacidi. La sua massa molecolare è 27 kD. Pertanto, la fusione del gene GFP con il gene di una proteina di interesse può aumentare significativamente le dimensioni e la massa molecolare della proteina e può compromettere la funzione naturale della proteina o modificarne la posizione o la traiettoria di trasporto all'interno della cellula.
Sfondo
GFP di tipo selvatico (wtGFP)
Negli anni '60 e '70, la GFP, insieme alla proteina luminescente separata equorina (un enzima che catalizza la scomposizione della luciferina , rilasciando luce), è stata purificata per la prima volta dalla medusa Aequorea victoria e le sue proprietà sono state studiate da Osamu Shimomura . In A. victoria , la fluorescenza della GFP si verifica quando l' equorina interagisce con gli ioni Ca 2+ , inducendo un bagliore blu. Parte di questa energia luminescente viene trasferita al GFP, spostando il colore generale verso il verde. Tuttavia, la sua utilità come strumento per i biologi molecolari non iniziò a realizzarsi fino al 1992, quando Douglas Prasher riportò la clonazione e la sequenza nucleotidica di wtGFP in Gene . I fondi per questo progetto si erano esauriti, quindi Prasher ha inviato campioni di cDNA a diversi laboratori. Il laboratorio di Martin Chalfie ha espresso la sequenza codificante di wtGFP, con i primi pochi amminoacidi deleti, in cellule eterologhe di E. coli e C. elegans , pubblicando i risultati su Science nel 1994. Il laboratorio di Frederick Tsuji ha riportato indipendentemente l'espressione del ricombinante proteine un mese dopo. Sorprendentemente, la molecola GFP si è piegata ed è risultata fluorescente a temperatura ambiente, senza la necessità di cofattori esogeni specifici per la medusa. Sebbene questo GFP vicino al peso fosse fluorescente, presentava diversi inconvenienti, tra cui spettri di eccitazione a doppio picco, sensibilità al pH, sensibilità al cloruro, scarsa resa quantica di fluorescenza, scarsa fotostabilità e scarsa piegatura a 37 ° C.
La prima struttura cristallina riportata di una GFP è stata quella del mutante S65T dal gruppo Remington su Science nel 1996. Un mese dopo, il gruppo Phillips ha riportato indipendentemente la struttura GFP wild-type in Nature Biotechnology . Queste strutture cristalline hanno fornito uno sfondo vitale sulla formazione dei cromofori e sulle interazioni con i residui vicini. I ricercatori hanno modificato questi residui mediante mutagenesi diretta e casuale per produrre l'ampia varietà di derivati della GFP attualmente in uso. Ulteriori ricerche sulla GFP hanno dimostrato che è resistente a detergenti, proteasi, trattamenti con cloruro di guanidinio (GdmCl) e drastici sbalzi di temperatura.
Derivati GFP
A causa del potenziale di utilizzo diffuso e delle esigenze in continua evoluzione dei ricercatori, sono stati progettati molti diversi mutanti di GFP. Il primo importante miglioramento è stata una mutazione a punto singolo (S65T) riportata nel 1995 su Nature da Roger Tsien . Questa mutazione ha notevolmente migliorato le caratteristiche spettrali della GFP, determinando un aumento della fluorescenza, della fotostabilità e uno spostamento del picco di eccitazione principale a 488 nm, con l'emissione di picco mantenuta a 509 nm. Ciò corrispondeva alle caratteristiche spettrali dei set di filtri FITC comunemente disponibili , aumentando la praticità d'uso da parte del ricercatore generale. Un mutante punto a 37 °C di efficienza di piegatura (F64L) di questo scaffold, che produce GFP potenziato ( EGFP ), è stato scoperto nel 1995 dai laboratori di Thastrup e Falkow. L'EGFP ha consentito l'uso pratico dei GFP nelle cellule di mammifero. EGFP ha un coefficiente di estinzione (indicato con ε) di 55.000 M -1 cm -1 . La resa quantica della fluorescenza (QY) di EGFP è 0,60. La luminosità relativa, espressa come ε•QY, è 33.000 M −1 cm −1 .
Nel 2006 è stata segnalata la superfolder GFP ( sfGFP ), una serie di mutazioni che consentono alla GFP di ripiegarsi e maturare rapidamente anche quando fusa a peptidi scarsamente ripiegabili.
Sono state fatte molte altre mutazioni, compresi i mutanti di colore; in particolare, proteina fluorescente blu (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteina fluorescente ciano (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) e derivati della proteina fluorescente gialla (YFP, Citrine, Venus, YPet). I derivati BFP (eccetto mKalama1) contengono la sostituzione Y66H. Presentano un'ampia banda di assorbimento nell'ultravioletto centrata vicino a 380 nanometri e un massimo di emissione a 448 nanometri. È stato sviluppato un mutante della proteina fluorescente verde ( BFPms1 ) che lega preferenzialmente Zn(II) e Cu(II) . BFPms1 ha diverse importanti mutazioni tra cui e il cromoforo BFP (Y66H), Y145F per una maggiore resa quantica, H148G per creare un buco nel beta-barile e molte altre mutazioni che aumentano la solubilità. Il legame Zn(II) aumenta l'intensità della fluorescenza, mentre il legame Cu(II) spegne la fluorescenza e sposta il massimo di assorbanza da 379 a 444 nm. Pertanto, possono essere utilizzati come biosensori di Zn.
Legame cromoforico . La mutazione critica nei derivati del ciano è la sostituzione Y66W, che fa sì che il cromoforo si formi con un componente indolo anziché fenolico. Sono necessarie diverse ulteriori mutazioni compensatorie nel barilotto circostante per ripristinare la luminosità di questo cromoforo modificato a causa dell'aumento della massa del gruppo indolo. In ECFP e Cerulean, la metà N-terminale del settimo filamento mostra due conformazioni. Queste conformazioni hanno entrambe un complesso insieme di interazioni di van der Waals con il cromoforo. Le mutazioni Y145A e H148D in Cerulean stabilizzano queste interazioni e consentono al cromoforo di essere più planare, meglio impaccato e meno incline all'estinzione da collisioni.
Un'ulteriore mutagenesi casuale diretta al sito in combinazione con lo screening basato sulla durata della fluorescenza ha ulteriormente stabilizzato il settimo filamento β risultando in una variante brillante, mTurquoise2, con una resa quantica (QY) di 0,93. La lunghezza d'onda spostata verso il rosso dei derivati YFP è ottenuta dalla mutazione T203Y ed è dovuta alle interazioni di impilamento di elettroni tra il residuo di tirosina sostituito e il cromoforo. Queste due classi di varianti spettrali sono spesso impiegate per esperimenti di trasferimento di energia per risonanza di Förster ( FRET ). I reporter FRET geneticamente codificati sensibili alle molecole di segnalazione cellulare, come il calcio o il glutammato, lo stato di fosforilazione delle proteine, la complementazione delle proteine, la dimerizzazione dei recettori e altri processi forniscono letture ottiche altamente specifiche dell'attività cellulare in tempo reale.
La mutagenesi semirazionale di un certo numero di residui ha portato a mutanti sensibili al pH noti come pHluorins e successivamente pHluorins super-eclittiche. Sfruttando il rapido cambiamento del pH alla fusione delle vescicole sinaptiche, le pHluorine marcate con la sinaptobrevina sono state utilizzate per visualizzare l'attività sinaptica nei neuroni.
La GFP sensibile al redox ( roGFP ) è stata progettata mediante l'introduzione di cisteine nella struttura del barilotto beta. Lo stato redox delle cisteine determina le proprietà fluorescenti di roGFP .
Nomenclatura
La nomenclatura delle GFP modificate è spesso confusa a causa della sovrapposizione di più versioni GFP su un unico nome. Ad esempio, mGFP si riferisce spesso a una GFP con una palmitoilazione N-terminale che fa sì che la GFP si leghi alle membrane cellulari . Tuttavia, lo stesso termine è anche usato per riferirsi alla GFP monomerica , che è spesso ottenuta dall'interfaccia dimerica che interrompe la mutazione A206K. La GFP wild-type ha una debole tendenza alla dimerizzazione a concentrazioni superiori a 5 mg/mL. mGFP sta anche per "GFP modificata", che è stata ottimizzata attraverso lo scambio di aminoacidi per un'espressione stabile nelle cellule vegetali.
In natura
Lo scopo della bioluminescenza (primaria) (dall'azione dell'equorina sulla luciferina) e della fluorescenza (secondaria) della GFP nelle meduse è sconosciuto. GFP è co-espresso con equorina in piccoli granuli attorno al bordo della campana della medusa. Il picco di eccitazione secondaria (480 nm) della GFP assorbe parte dell'emissione blu dell'equorina, conferendo alla bioluminescenza una tonalità più verde. Il residuo di serina 65 del cromoforo GFP è responsabile degli spettri di eccitazione a doppio picco della GFP wild-type. È conservata in tutte e tre le isoforme GFP originariamente clonate da Prasher. Quasi tutte le mutazioni di questo residuo consolidano gli spettri di eccitazione a un singolo picco a 395 nm o 480 nm. Il meccanismo preciso di questa sensibilità è complesso, ma, a quanto pare, implica la donazione di un idrogeno dalla serina 65 al glutammato 222, che influenza la ionizzazione del cromoforo. Poiché una singola mutazione può aumentare notevolmente il picco di eccitazione di 480 nm, rendendo la GFP un partner molto più efficiente dell'equorina, A. victoria sembra preferire evolutivamente lo spettro di eccitazione a doppio picco meno efficiente. Roger Tsien ha ipotizzato che la variazione della pressione idrostatica con la profondità possa influenzare la capacità della serina 65 di donare idrogeno al cromoforo e spostare il rapporto dei due picchi di eccitazione. Pertanto, la medusa può cambiare il colore della sua bioluminescenza con la profondità. Tuttavia, un crollo della popolazione di meduse a Friday Harbor , dove è stata originariamente scoperta la GFP, ha ostacolato ulteriori studi sul ruolo della GFP nell'ambiente naturale delle meduse.
La maggior parte delle specie di lancette sono note per produrre GFP in varie regioni del loro corpo. A differenza di A. victoria , le lancette non producono la propria luce blu e l'origine della loro GFP endogena è ancora sconosciuta. Alcuni ipotizzano che attiri il plancton verso la bocca della lancetta, fungendo da meccanismo passivo di caccia. Può anche fungere da agente fotoprotettivo nelle larve, prevenendo i danni causati dalla luce blu ad alta intensità convertendola in luce verde a bassa intensità. Tuttavia, queste teorie non sono state testate.
Proteine simili alla GFP sono state trovate in più specie di copepodi marini , in particolare dalle famiglie Pontellidae e Aetideidae . GFP isolato da Pontella mimocerami ha mostrato alti livelli di luminosità con una resa quantica di 0,92, rendendoli quasi due volte più luminosi dell'EGFP comunemente usato isolato da A. victoria.
Altre proteine fluorescenti
Esistono molte proteine simili alla GFP che, pur appartenendo alla stessa famiglia proteica della GFP, non sono direttamente derivate da Aequorea victoria . Questi includono dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFP, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra e così via. Essendo state sviluppate da proteine in diversi organismi, queste proteine a volte possono mostrare approcci imprevisti alla formazione dei cromofori. Alcuni di questi, come KFP, sono sviluppati da proteine naturalmente non fluorescenti o debolmente fluorescenti per essere notevolmente migliorati dalla mutagenesi. Quando vengono utilizzati barili GFP con caratteristiche spettrali diverse, gli spettri di eccitazione di un cromoforo possono essere utilizzati per alimentare un altro cromoforo (FRET), consentendo la conversione tra lunghezze d'onda della luce.
Le proteine fluorescenti che legano FMN (FbFP) sono state sviluppate nel 2007 e sono una classe di piccole proteine fluorescenti (11-16 kDa), indipendenti dall'ossigeno, derivate dai recettori della luce blu. Sono destinati soprattutto all'uso in condizioni anaerobiche o ipossiche, poiché la formazione e il legame del cromoforo Flavin non richiede ossigeno molecolare, come nel caso della sintesi del cromoforo GFP.
Le proteine fluorescenti con altri cromofori, come UnaG con bilirubina, possono mostrare proprietà uniche come l'emissione spostata verso il rosso sopra i 600 nm o la fotoconversione da uno stato di emissione del verde a uno stato di emissione del rosso. Possono avere lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione abbastanza distanti da ottenere la conversione tra luce rossa e verde.
Una nuova classe di proteine fluorescenti è stata evoluta da una ficobiliproteina cianobatterica ( Trichodesmium erythraeum ) , α- alloficocianina , e denominata piccola proteina fluorescente ultra rossa ( smURFP ) nel 2016. smURFP autocataliticamente auto-incorpora il cromoforo biliverdina senza la necessità di una proteina esterna , noto come liasi . Le proteine simili alla GFP derivate dalle meduse e dai coralli richiedono ossigeno e producono una quantità stechiometrica di perossido di idrogeno al momento della formazione del cromoforo . smURFP non richiede ossigeno né produce perossido di idrogeno e utilizza il cromoforo , la biliverdina . smURFP ha un grande coefficiente di estinzione (180.000 M -1 cm -1 ) e ha una resa quantica modesta (0,20), che lo rende paragonabile alla luminosità biofisica di eGFP e ~ 2 volte più luminoso della maggior parte delle proteine fluorescenti rosse o molto rosse derivate da corallo . Le proprietà spettrali di smURFP sono simili al colorante organico Cy5 .
Recensioni su nuove classi di proteine fluorescenti e applicazioni possono essere trovate nelle recensioni citate.
Struttura
GFP ha una struttura a botte beta costituita da undici filamenti con una disposizione a fogli pieghettati, con un'elica alfa contenente il cromoforo 4-( p- idrossibenzilidene)imidazolidin-5-one (HBI) legato in modo covalente che attraversa il centro. Cinque alfa eliche più corte formano cappucci alle estremità della struttura. La struttura del barilotto beta è un cilindro quasi perfetto, lungo 42Å e 24Å di diametro (alcuni studi hanno riportato un diametro di 30Å), creando quella che viene definita una formazione "β-can", che è unica per la famiglia simile alla GFP . L'HBI, la forma spontaneamente modificata del tripeptide Ser65-Tyr66-Gly67, non è fluorescente in assenza dello scaffold GFP opportunamente ripiegato ed esiste principalmente nella forma fenolica non ionizzata in wtGFP. Le catene laterali rivolte verso l'interno della canna inducono specifiche reazioni di ciclizzazione in Ser65-Tyr66-Gly67 che inducono la ionizzazione di HBI alla forma fenolata e alla formazione di cromofori . Questo processo di modificazione post-traduzionale è indicato come maturazione . La rete di legami idrogeno e le interazioni di impilamento degli elettroni con queste catene laterali influenzano il colore, l'intensità e la fotostabilità della GFP e dei suoi numerosi derivati. La natura compatta della canna esclude le molecole di solvente, proteggendo la fluorescenza del cromoforo dall'estinzione da parte dell'acqua. Oltre all'autociclizzazione del Ser65-Tyr66-Gly67, si verifica una reazione di 1,2-deidrogenazione sul residuo Tyr66. Oltre ai tre residui che formano il cromoforo, residui come Gln94, Arg96, His148, Thr203 e Glu222 agiscono tutti come stabilizzanti. I residui di Gln94, Arg96 e His148 sono in grado di stabilizzarsi delocalizzando la carica cromofora. Arg96 è il residuo stabilizzante più importante per il fatto che richiede i necessari riallineamenti strutturali che sono necessari dall'anello HBI. Qualsiasi mutazione al residuo Arg96 comporterebbe una diminuzione della velocità di sviluppo del cromoforo perché le interazioni elettrostatiche e steriche corrette andrebbero perse. Tyr66 è il destinatario di legami idrogeno e non ionizza per produrre elettrostatica favorevole.
Molecole GFP disegnate in stile cartone animato, una completamente e l'altra con il lato del barilotto beta tagliato per rivelare il cromoforo (evidenziato come palla e bastone ). Dal PDB : 1GFL .
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Applicazioni
Saggi del giornalista
La proteina fluorescente verde può essere utilizzata come gene reporter .
Ad esempio, GFP può essere utilizzato come reporter per i livelli di tossicità ambientale. Questa proteina ha dimostrato di essere un modo efficace per misurare i livelli di tossicità di varie sostanze chimiche tra cui etanolo, p- formaldeide, fenolo, triclosan e parabeni. La GFP è ottima come proteina reporter perché non ha alcun effetto sull'ospite quando viene introdotta nell'ambiente cellulare dell'ospite. A causa di questa capacità, non sono necessarie macchie di visualizzazione esterna, ATP o cofattori. Per quanto riguarda i livelli di inquinanti, è stata misurata la fluorescenza per valutare l'effetto che gli inquinanti hanno sulla cellula ospite. È stata anche misurata la densità cellulare della cellula ospite. I risultati dello studio condotto da Song, Kim e Seo (2016) hanno mostrato una diminuzione sia della fluorescenza che della densità cellulare all'aumentare dei livelli di inquinanti. Questo era indicativo del fatto che l'attività cellulare era diminuita. Ulteriori ricerche su questa specifica applicazione al fine di determinare il meccanismo con cui la GFP agisce come marcatore inquinante. Risultati simili sono stati osservati in zebrafish perché zebrafish che è stato iniettato con GFP era circa venti volte più suscettibile di riconoscere gli stress cellulari rispetto a zebrafish che non è stato iniettato con GFP.
Vantaggi
Il più grande vantaggio della GFP è che può essere ereditabile, a seconda di come è stata introdotta, consentendo lo studio continuo delle cellule e dei tessuti in cui è espressa. La visualizzazione della GFP non è invasiva e richiede solo l'illuminazione con luce blu. La GFP da sola non interferisce con i processi biologici, ma quando viene fusa con le proteine di interesse, è necessaria un'attenta progettazione dei linker per mantenere la funzione della proteina di interesse. Inoltre, se utilizzato con un monomero è in grado di diffondere facilmente attraverso le cellule.
Microscopia a fluorescenza
La disponibilità di GFP e dei suoi derivati ha ridefinito completamente la microscopia a fluorescenza e il modo in cui viene utilizzata nella biologia cellulare e in altre discipline biologiche. Mentre la maggior parte delle piccole molecole fluorescenti come il FITC (isotiocianato di fluoresceina) sono fortemente fototossiche quando vengono utilizzate nelle cellule vive, le proteine fluorescenti come la GFP sono generalmente molto meno dannose se illuminate nelle cellule viventi. Ciò ha innescato lo sviluppo di sistemi di microscopia a fluorescenza di cellule vive altamente automatizzati, che possono essere utilizzati per osservare le cellule nel tempo che esprimono una o più proteine etichettate con proteine fluorescenti.
Esistono molte tecniche per utilizzare la GFP in un esperimento di imaging di cellule vive. Il modo più diretto di utilizzare GFP è collegarlo direttamente a una proteina di interesse. Ad esempio, la GFP può essere inclusa in un plasmide che esprime altri geni per indicare una trasfezione riuscita di un gene di interesse. Un altro metodo consiste nell'utilizzare un GFP che contiene una mutazione in cui la fluorescenza cambierà da verde a gialla nel tempo, che viene definita timer fluorescente. Con il timer fluorescente, i ricercatori possono studiare lo stato della produzione di proteine come l'attivazione recente, l'attivazione continua o la disattivazione recente in base al colore riportato dalla proteina fluorescente. In un altro esempio, gli scienziati hanno modificato la GFP in modo che diventi attiva solo dopo l'esposizione all'irradiazione, fornendo ai ricercatori uno strumento per attivare selettivamente determinate porzioni di una cellula e osservare dove le proteine etichettate con la GFP si spostano dalla posizione di partenza. Questi sono solo due esempi in un fiorente campo di microcopie fluorescenti e una rassegna più completa di biosensori che utilizzano GFP e altre proteine fluorescenti può essere trovata qui
Ad esempio, la GFP è stata ampiamente utilizzata nell'etichettatura degli spermatozoi di vari organismi per scopi di identificazione come in Drosophila melanogaster , dove l'espressione di GFP può essere utilizzata come marcatore per una particolare caratteristica. La GFP può anche essere espressa in diverse strutture che consentono la distinzione morfologica. In tali casi, il gene per la produzione di GFP è incorporato nel genoma dell'organismo nella regione del DNA che codifica per le proteine bersaglio e che è controllata dalla stessa sequenza regolatoria ; cioè, la sequenza regolatoria del gene ora controlla la produzione di GFP, oltre alle proteine etichettate. Nelle cellule in cui viene espresso il gene e vengono prodotte le proteine etichettate, viene prodotta contemporaneamente la GFP. Pertanto, solo le cellule in cui è espresso il gene marcato o vengono prodotte le proteine bersaglio, emetteranno una fluorescenza quando osservate al microscopio a fluorescenza. L'analisi di tali filmati time lapse ha ridefinito la comprensione di molti processi biologici tra cui il ripiegamento delle proteine, il trasporto delle proteine e la dinamica dell'RNA, che in passato erano stati studiati utilizzando materiale fisso (cioè morto). I dati ottenuti vengono utilizzati anche per calibrare modelli matematici dei sistemi intracellulari e per stimare i tassi di espressione genica. Allo stesso modo, la GFP può essere utilizzata come indicatore dell'espressione proteica in sistemi eterologhi. In questo scenario, le proteine di fusione contenenti GFP vengono introdotte indirettamente, utilizzando l'RNA del costrutto, o direttamente, con la stessa proteina marcata. Questo metodo è utile per studiare le caratteristiche strutturali e funzionali della proteina marcata su scala macromolecolare o singola molecola con microscopia a fluorescenza.
Il microscopio Vertico SMI che utilizza la tecnologia SPDM Phymod utilizza il cosiddetto effetto "photobleaching reversibile" di coloranti fluorescenti come GFP e suoi derivati per localizzarli come singole molecole con una risoluzione ottica di 10 nm. Questo può essere eseguito anche come co-localizzazione di due derivati GFP (2CLM).
Un altro potente uso della GFP è esprimere la proteina in piccoli gruppi di cellule specifiche. Ciò consente ai ricercatori di rilevare otticamente tipi specifici di cellule in vitro (in un piatto) o anche in vivo (nell'organismo vivente). La combinazione genetica di diverse varianti spettrali di GFP è un utile trucco per l'analisi dei circuiti cerebrali ( Brainbow ). Altri usi interessanti delle proteine fluorescenti in letteratura includono l'utilizzo di FP come sensori del potenziale di membrana neuronale , il monitoraggio dei recettori AMPA sulle membrane cellulari, l'ingresso virale e l'infezione di singoli virus influenzali e virus lentivirali, ecc.
È stato anche scoperto che nuove linee di ratti GFP transgenici possono essere rilevanti per la terapia genica e per la medicina rigenerativa. Usando la GFP "high-expresser", i ratti transgenici mostrano un'alta espressione nella maggior parte dei tessuti e molte cellule che non sono state caratterizzate o sono state caratterizzate solo male nei precedenti ratti transgenici GFP.
GFP ha dimostrato di essere utile in criobiologia come saggio di fattibilità . La correlazione della vitalità misurata con i test del tripan blue è stata di 0,97. Un'altra applicazione è l'uso della co-trasfezione con GFP come controllo interno per l'efficienza della trasfezione nelle cellule di mammifero.
Un nuovo possibile utilizzo della GFP include l'utilizzo come monitor sensibile dei processi intracellulari tramite un sistema laser eGFP costituito da una linea cellulare renale embrionale umana. Il primo laser vivente ingegnerizzato è costituito da una cella che esprime eGFP all'interno di una cavità ottica riflettente e la colpisce con impulsi di luce blu. Ad una certa soglia di impulso, l'uscita ottica dell'eGFP diventa più luminosa e completamente uniforme di colore verde puro con una lunghezza d'onda di 516 nm. Prima di essere emessa come luce laser, la luce rimbalza avanti e indietro all'interno della cavità del risonatore e attraversa la cellula numerose volte. Studiando i cambiamenti nell'attività ottica, i ricercatori possono comprendere meglio i processi cellulari.
La GFP è ampiamente utilizzata nella ricerca sul cancro per etichettare e tracciare le cellule tumorali. Le cellule tumorali marcate con GFP sono state utilizzate per modellare la metastasi, il processo mediante il quale le cellule tumorali si diffondono a organi distanti.
Dividi GFP
La GFP può essere utilizzata per analizzare la colocalizzazione delle proteine. Ciò si ottiene "dividendo" la proteina in due frammenti in grado di autoassemblarsi, e quindi fondendo ciascuno di questi con le due proteine di interesse. Da soli, questi frammenti GFP incompleti non sono in grado di emettere fluorescenza. Tuttavia, se le due proteine di interesse colocalizzano, i due frammenti GFP si assemblano insieme per formare una struttura simile alla GFP che è in grado di emettere fluorescenza. Pertanto, misurando il livello di fluorescenza è possibile determinare se le due proteine di interesse colocalizzano.
Macrofotografia
I processi biologici su scala macro, come la diffusione di infezioni virali, possono essere seguiti utilizzando l'etichettatura GFP. In passato, la luce ultravioletta mutagena (UV) è stata utilizzata per illuminare gli organismi viventi (ad esempio, vedere) per rilevare e fotografare l'espressione della GFP. Recentemente, è stata sviluppata una tecnica che utilizza luci LED non mutagene per la macrofotografia. La tecnica utilizza un attacco per fotocamera a epifluorescenza basato sullo stesso principio utilizzato nella costruzione dei microscopi a epifluorescenza .
Animali transgenici
Alba , un coniglio verde fluorescente, è stato creato da un laboratorio francese commissionato da Eduardo Kac utilizzando GFP per scopi artistici e di commento sociale. La società statunitense Yorktown Technologies commercializza nei negozi di acquari il pesce zebra fluorescente verde ( GloFish ) inizialmente sviluppato per rilevare l'inquinamento nei corsi d'acqua. NeonPets, una società con sede negli Stati Uniti, ha commercializzato topi fluorescenti verdi per l'industria degli animali domestici come NeonMice. I maiali fluorescenti verdi, conosciuti come Noels, sono stati allevati da un gruppo di ricercatori guidati da Wu Shinn-Chih presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Animali della National Taiwan University . Un team giapponese-americano ha creato gatti fluorescenti verdi come prova del concetto per utilizzarli potenzialmente come organismi modello per malattie, in particolare l' HIV . Nel 2009 un team sudcoreano della Seoul National University ha allevato i primi beagle transgenici con cellule di fibroblasti di anemoni di mare. I cani emettono una luce fluorescente rossa e hanno lo scopo di consentire agli scienziati di studiare i geni che causano malattie umane come la narcolessia e la cecità.
Arte
Julian Voss-Andreae , un artista di origine tedesca specializzato in "sculture proteiche", ha creato sculture basate sulla struttura della GFP, tra cui la "Green Fluorescent Protein" (2004) alta 1,70 m (5'6") e la 1,40 m ( 4'7") di altezza "Medusa d'acciaio" (2006). Quest'ultima scultura si trova nel luogo della scoperta di GFP da parte di Shimomura nel 1962, i Friday Harbor Laboratories dell'Università di Washington .
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Guarda anche
- Etichetta proteica
- pGLO
- Proteina fluorescente gialla
- Indicatore di tensione geneticamente codificato
Riferimenti
Ulteriori letture
- Pieribone V, Gruber D (2006). Brillante nel buio: la scienza rivoluzionaria della biofluorescenza . Cambridge: Belknap Press. ISBN 978-0-674-01921-8. OCLC 60321612 . Libro scientifico popolare che descrive la storia e la scoperta della GFP
- Zimmer M (2005). Geni luminosi: una rivoluzione nella biotecnologia . Buffalo, NY: Prometheus Books. ISBN 978-1-59102-253-4. OCLC 56614624 .
link esterno
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Risorse della biblioteca sulla proteina fluorescente verde |
- Un articolo completo sulle proteine fluorescenti su Scholarpedia
- Breve riassunto dei documenti storici della GFP
- Applet Java interattivo che dimostra la chimica dietro la formazione del cromoforo GFP
- Video della conferenza del Premio Nobel 2008 di Roger Tsien sulle proteine fluorescenti
- Spettri di eccitazione ed emissione per varie proteine fluorescenti
- Green Fluorescent Protein Chem Soc Rev numero a tema dedicato ai vincitori del Premio Nobel 2008 per la Chimica, Professori Osamu Shimomura , Martin Chalfie e Roger Y. Tsien
- Molecola del mese, giugno 2003 : una panoramica illustrata della GFP di David Goodsell.
- Molecola del mese, giugno 2014 : una panoramica illustrata delle varianti simili a GFP di David Goodsell.
- Green Fluorescent Protein su FPbase, un database di proteine fluorescenti
- Panoramica di tutte le informazioni strutturali disponibili nel PDB per UniProt : P42212 (proteina fluorescente verde) presso il PDB-KB .