Illuminazione Köhler - Köhler illumination

L'illuminazione Köhler è un metodo di illuminazione del campione utilizzato per la microscopia ottica a luce trasmessa e riflessa (trans- ed epi-illuminata) . L'illuminazione Köhler agisce per generare un'illuminazione uniforme del campione e garantisce che un'immagine della sorgente di illuminazione (ad esempio un filamento di una lampada alogena ) non sia visibile nell'immagine risultante. L'illuminazione Köhler è la tecnica predominante per l'illuminazione dei campioni nella moderna microscopia ottica scientifica. Richiede elementi ottici aggiuntivi che sono più costosi e potrebbero non essere presenti in microscopi ottici di base.

Storia e motivazione

Prima dell'illuminazione Köhler, l'illuminazione critica era la tecnica predominante per l'illuminazione dei campioni. L'illuminazione critica ha la principale limitazione che l'immagine della sorgente luminosa (tipicamente una lampadina ) cade sullo stesso piano dell'immagine del campione, cioè il filamento della lampadina è visibile nell'immagine finale. L'immagine della sorgente luminosa viene spesso definita immagine del filamento . L'illuminazione critica quindi fornisce un'illuminazione irregolare del campione; le regioni luminose nell'immagine del filamento illuminano quelle regioni del campione in modo più intenso. Un'illuminazione non uniforme è indesiderabile in quanto può introdurre artefatti come bagliori e ombre nell'immagine.

Vari metodi possono essere utilizzati per diffondere l'immagine del filamento, inclusa la riduzione della potenza alla sorgente di luce o l'utilizzo di una lampadina in vetro opale o un diffusore in vetro opale tra la lampadina e il campione. Questi metodi sono tutti, in una certa misura, funzionali a ridurre l'irregolarità dell'illuminazione, tuttavia tutti riducono l'intensità dell'illuminazione e alterano la gamma di lunghezze d'onda della luce che raggiungono il campione.

Per affrontare queste limitazioni August Köhler ha progettato un metodo di illuminazione che utilizza un'immagine perfettamente sfocata della sorgente di luce per illuminare il campione. Questo lavoro fu pubblicato nel 1893 nella Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie e fu presto seguito dalla pubblicazione di una traduzione inglese nel Journal of the Royal Microscopical Society .

L'illuminazione Köhler è stata sviluppata anche nel contesto dell'ottica senza immagine .

Principi ottici

Il limite principale dell'illuminazione critica è la formazione di un'immagine della sorgente di luce nel piano dell'immagine del campione. L'illuminazione Köhler risolve questo problema assicurando che l'immagine della sorgente luminosa sia perfettamente sfocata nel piano del campione e nei suoi piani dell'immagine coniugata . In un diagramma a raggi del percorso della luce di illuminazione, questo può essere visto come i raggi che formano l'immagine che passano paralleli attraverso il campione.

L'illuminazione Köhler richiede diversi componenti ottici per funzionare:

  1. Lente del collettore e / o lente di campo
  2. Diaframma di campo
  3. Membrana condensatore
  4. Lente del condensatore
Schemi dell'illuminazione di Köhler. In alto: percorso del raggio di illuminazione. Piani coniugati contrassegnati da una barra verde chiaro. In basso: percorso del raggio di imaging. Piani coniugati contrassegnati da una barra azzurra Vedere il testo per ulteriori dettagli.

Questi componenti si trovano in questo ordine tra la sorgente di luce e il campione e controllano l'illuminazione del campione. Le lenti del collettore / campo agiscono per raccogliere la luce dalla sorgente luminosa e focalizzarla sul piano del diaframma del condensatore. La lente del condensatore agisce per proiettare questa luce, senza focalizzarla, attraverso il campione. Questo schema di illuminazione crea due serie di piani dell'immagine coniugati, uno con l'immagine della sorgente di luce e uno con il campione. Questi due set di piani immagine si trovano nei seguenti punti (vedi immagine per numeri e lettere):

Piani dell'immagine della sorgente luminosa (etichettati con una barra verde chiaro nell'immagine):
  • Filamento della lampada (1)
  • Membrana condensatore (2)
  • Piano focale posteriore dell'obiettivo (3)
  • Il punto di vista (4)
Piani di immagine del campione:
  • Diaframma di campo (A)
  • Campione (B)
  • Piano dell'immagine intermedio (il diaframma dell'oculare) (C)
  • La retina dell'occhio o il sensore della fotocamera (D)

Vantaggi

Il vantaggio principale dell'illuminazione Köhler è l'illuminazione uniforme del campione. Ciò riduce gli artefatti dell'immagine e fornisce un elevato contrasto del campione. L'illuminazione uniforme del campione è fondamentale anche per tecniche di illuminazione avanzate come il contrasto di fase e la microscopia a contrasto di interferenza differenziale .

La regolazione del diaframma del condensatore altera il contrasto del campione . Inoltre, la modifica delle dimensioni del diaframma del condensatore consente la regolazione della profondità di campo del campione alterando l'effettiva apertura numerica del microscopio. Il ruolo del diaframma del condensatore è analogo all'apertura in fotografia sebbene il diaframma del condensatore di un microscopio funzioni controllando l'illuminazione del campione, mentre l'apertura di una fotocamera funziona controllando l'illuminazione del rivelatore.

La modifica del diaframma del condensatore consente di regolare liberamente la quantità di luce che entra nel campione senza alterare le lunghezze d'onda della luce presente, contrariamente alla riduzione della potenza alla sorgente luminosa con illuminazione critica (che cambia la temperatura del colore della lampada). Questa regolazione è sempre accoppiata ad una variazione dell'apertura numerica del sistema, come detto sopra, per cui è ancora necessaria la regolazione dell'intensità della sorgente di illuminazione con altri mezzi.

Regolando il diaframma di campo, l'immagine dell'apertura del diaframma di campo nel piano del campione viene impostata su una dimensione leggermente più grande della regione del campione sottoposta a immagine (che corrisponde a sua volta alla porzione dell'immagine del campione proiettata nel fermo di campo dell'oculare ). Poiché il diaframma di campo, il campione e l'arresto di campo dell'oculare si trovano tutti su piani dell'immagine coniugata , questa regolazione consente ai raggi di illuminazione di riempire completamente il campo visivo dell'oculare, riducendo al minimo la quantità di luce estranea che deve essere bloccata dall'arresto di campo dell'oculare. Tale luce estranea si disperde all'interno del sistema e degrada il contrasto.

Verifica e configurazione dell'illuminazione Köhler

I microscopi che utilizzano l'illuminazione Köhler devono essere controllati regolarmente per verificarne il corretto allineamento. La procedura di riallineamento verifica se i componenti ottici corretti sono a fuoco sulle due serie di piani dell'immagine coniugata; i piani dell'immagine della sorgente di luce e i piani dell'immagine del campione.

L'allineamento dei componenti ottici sul piano dell'immagine del campione viene tipicamente eseguito caricando prima un campione di prova e portandolo a fuoco spostando l'obiettivo o il campione. Il diaframma di campo viene quindi parzialmente chiuso; i bordi del diaframma dovrebbero trovarsi sugli stessi piani dell'immagine coniugata del campione, quindi dovrebbero apparire a fuoco. La messa a fuoco può essere regolata alzando o abbassando le lenti del condensatore e il diaframma. Infine, il diaframma di campo viene riaperto appena oltre il campo visivo.

Per testare l'allineamento dei componenti sul piano dell'immagine della sorgente di luce, l'oculare deve essere rimosso per consentire l'osservazione del piano dell'immagine intermedio (la posizione del diaframma dell'oculare) direttamente o utilizzando un telescopio di fase / lente Bertrand . La sorgente luminosa (ad es. Il filamento della lampadina) ei bordi del diaframma del condensatore dovrebbero apparire a fuoco. Dovrebbero apparire a fuoco anche tutti i componenti ottici sul piano focale posteriore dell'obiettivo (ad esempio l'anello di fase per la microscopia a contrasto di fase) e sul diaframma del condensatore (ad esempio l'anulus per la microscopia a contrasto di fase).

Guarda anche

Riferimenti

  1. ^ Köhler, agosto (1893). "Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke" . Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für Mikroskopische Technik . 10 (4): 433–440.
  2. ^ Koehler, agosto (1894). "Nuovo metodo di illuminazione per scopi fotomicrografici" . Giornale della Royal Microscopical Society . 14 : 261–262.
  3. ^ Chaves, Julio (2015). Introduzione all'ottica non per immagini, seconda edizione . CRC Press . ISBN   978-1482206739 .

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