Luciferasi - Luciferase

Famiglia batterica della luciferasi monoossigenasi
Identificatori
Simbolo Bac_luciferasi
Pfam PF00296
InterPro IPR016048
PROSITO PDOC00397
SCOP2 1nfp / SCOPe / SUPFAM
Dominio catalitico dinoflagellato luciferasi
PDB 1vpr EBI.jpg
struttura cristallina di un dominio luciferasico dal dinoflagellato Lingulodinium polyedrum
Identificatori
Simbolo Luciferasi_cat
Pfam PF10285
InterPro IPR018804
Dinoflagellato Luciferasi/LBP Dominio N-terminale
Identificatori
Simbolo Luciferasi_N
Pfam PF05295
InterPro IPR007959
Dominio del fascio elicoidale di Dinoflagellate Luciferase
Identificatori
Simbolo Luciferasi_3H
Pfam PF10284
InterPro IPR018475

Luciferasi è un termine generico per la classe di enzimi ossidativi che producono bioluminescenza e di solito si distingue da una fotoproteina . Il nome fu usato per la prima volta da Raphaël Dubois che inventò le parole luciferina e luciferasi, rispettivamente per l' enzima e . Entrambe le parole derivano dalla parola latina lucifer , che significa "portatore di luce", che a sua volta deriva dalle parole latine per "luce" ( lux) e "portare o portare" ( ferre) .

Luciferasi di lucciola
Lucciola Luciferasi Crystal Structure.rsh.png
Struttura della luciferasi della lucciola di Photinus pyralis .
Identificatori
Organismo Photinus pyralis
Simbolo Luciferasi di lucciola
PDB 1LCI Più strutture
UniProt P08659
Altri dati
numero CE 1.13.12.7

Le luciferasi sono ampiamente utilizzate in biotecnologia , per la microscopia e come geni reporter , per molte delle stesse applicazioni delle proteine ​​fluorescenti . Tuttavia, a differenza delle proteine ​​fluorescenti, le luciferasi non richiedono una fonte di luce esterna , ma richiedono l'aggiunta di luciferina , il substrato consumabile.

Esempi

Una varietà di organismi regola la loro produzione di luce utilizzando diverse luciferasi in una varietà di reazioni di emissione di luce. La maggior parte delle luciferasi studiate è stata trovata negli animali, comprese le lucciole e in molti animali marini come copepodi , meduse e viola del pensiero . Tuttavia, le luciferasi sono state studiate in funghi luminosi, come il fungo Jack-O-Lantern , così come esempi in altri regni tra cui batteri luminosi e dinoflagellati .

Lucciola e scarabeo clic

Le luciferasi delle lucciole – di cui esistono oltre 2000 specie – e degli altri Elateroidea (clic coleotteri e parenti in genere) sono abbastanza diverse da essere utili nella filogenesi molecolare . Nelle lucciole, l'ossigeno necessario viene fornito attraverso un tubo nell'addome chiamato trachea addominale . Una luciferasi ben studiato è quello della Photinini lucciola pyralis Photinus , che ha un pH ottimale di 7,8.

Viola del pensiero di mare

Ben studiata è anche la viola del pensiero marina , Renilla reniformis . In questo organismo, la luciferasi ( Renilla-luciferina 2-monoossigenasi ) è strettamente associata a una proteina legante la luciferina ea una proteina fluorescente verde ( GFP ). Il calcio innesca il rilascio della luciferina ( celenterazina ) dalla proteina legante la luciferina. Il substrato è quindi disponibile per l' ossidazione da parte della luciferasi, dove viene degradato a celeenteramide con un conseguente rilascio di energia. In assenza di GFP, questa energia verrebbe rilasciata come fotone di luce blu (lunghezza d'onda di emissione di picco 482 nm). Tuttavia, a causa della GFP strettamente associata, l'energia rilasciata dalla luciferasi viene invece accoppiata tramite trasferimento di energia di risonanza al fluoroforo della GFP, e viene successivamente rilasciata come fotone di luce verde (lunghezza d'onda di emissione di picco 510 nm). La reazione catalizzata è:

copepode

Recentemente sono state identificate nuove luciferasi che, a differenza di altre luciferasi, sono molecole secrete naturalmente. Un esempio è la luciferasi Metridia coelenterazina- dipendente (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) che deriva dal copepode marino Metridia longa . Il gene della luciferasi secreto da Metridia longa codifica per una proteina di 24 kDa contenente un peptide segnale secretorio N-terminale di 17 residui di amminoacidi. La sensibilità e l'elevata intensità del segnale di questa molecola di luciferasi si rivela vantaggiosa in molti studi di reporter. Alcuni dei vantaggi dell'utilizzo di una molecola reporter secreta come MetLuc è il suo protocollo di non lisi che consente di essere in grado di condurre saggi su cellule vive e più saggi sulla stessa cellula.

batterico

La bioluminescenza batterica è presente nelle specie Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi e Vibrio harveyi . L'emissione di luce in alcuni batteri bioluminescenti utilizza "antenna" come la proteina lumazina per accettare l'energia dallo stato eccitato primario sulla luciferasi, risultando in un cromoforo di lulnazina eccitato che emette luce di lunghezza d'onda più corta (più blu), mentre in altri usa una proteina fluorescente gialla (YFP) con FMN come cromoforo ed emette luce che è spostata verso il rosso rispetto a quella della luciferasi.

Dinoflagellato

La luciferasi dinoflagellata è una proteina eucariota multidominio , costituita da un dominio N-terminale e tre domini catalitici , ciascuno dei quali preceduto da un dominio a fascio elicoidale. La struttura del dominio catalitico della dinoflagellato luciferasi è stata risolta. La parte centrale del dominio è un barile beta a 10 filamenti che è strutturalmente simile a lipocaline e FABP . Il dominio N-terminale è conservato tra la luciferasi dinoflagellata e le proteine ​​leganti la luciferina (LBP). È stato suggerito che questa regione possa mediare un'interazione tra LBP e luciferasi o la loro associazione con la membrana vacuolare . Il dominio fascio elicoidale ha un tre fascio elica struttura che contiene quattro importanti istidine che si pensa di svolgere un ruolo nel pH regolazione del enzima . C'è una grande tasca nel -barile della luciferasi dinoflagellata a pH 8 per accogliere il substrato del tetrapirrolo ma non c'è alcuna apertura per consentire al substrato di entrare. Pertanto, deve verificarsi un significativo cambiamento conformazionale per fornire accesso e spazio per un ligando nel sito attivo e la fonte di questo cambiamento è attraverso i quattro residui di istidina N-terminali. A pH 8, si può vedere che i residui di istidina non protonata sono coinvolti in una rete di legami idrogeno all'interfaccia delle eliche nel fascio che bloccano l'accesso del substrato al sito attivo e l'interruzione di questa interazione per protonazione (a pH 6,3) oppure per sostituzione dei residui istidinici con alanina provoca un grande movimento molecolare del fascio, separando le eliche di 11' e aprendo il sito catalitico. Logicamente, i residui di istidina non possono essere sostituiti in natura dall'alanina, ma questa sostituzione sperimentale conferma ulteriormente che i residui di istidina più grandi bloccano il sito attivo. Inoltre, tre sequenze Gly-Gly, una nell'elica N-terminale e due nel motivo elica-ansa-elica, potrebbero fungere da cardini attorno ai quali ruotano le catene per aprire ulteriormente il percorso verso il sito catalitico e ingrandire il posto.

Una luciferasi dinoflagellata è in grado di emettere luce a causa della sua interazione con il suo substrato ( luciferina ) e la proteina legante la luciferina (LBP) nell'organello scintillone che si trova nei dinoflagellati. La luciferasi agisce in accordo con luciferina e LBP per emettere luce, ma ogni componente funziona a un pH diverso. La luciferasi e i suoi domini non sono attivi a pH 8 ma sono estremamente attivi al pH ottimale di 6,3 mentre LBP lega la luciferina a pH 8 e la rilascia a pH 6,3. Di conseguenza, la luciferina viene rilasciata per reagire con una luciferasi attiva solo quando lo scintillon viene acidificato a pH 6,3. Pertanto, al fine di abbassare il pH, vengono aperti dei canali voltaggio-dipendenti nella membrana di scintillon per consentire l'ingresso di protoni da un vacuolo che possiede un potenziale d'azione prodotto da una stimolazione meccanica. Quindi, si può vedere che il potenziale d'azione nella membrana vacuolare porta all'acidificazione e questo a sua volta consente alla luciferina di essere rilasciata per reagire con la luciferasi nello scintillon, producendo un lampo di luce blu.

Meccanismo di reazione

Tutte le luciferasi sono classificate come ossidoriduttasi ( EC 1.13.12.- ), nel senso che agiscono su singoli donatori con incorporazione di ossigeno molecolare. Poiché le luciferasi provengono da molte famiglie proteiche diverse che non sono correlate, non esiste un meccanismo unificante, poiché qualsiasi meccanismo dipende dalla combinazione di luciferasi e luciferina. Tuttavia, tutte le reazioni luciferasi-luciferina caratterizzate fino ad oggi hanno dimostrato di richiedere ossigeno molecolare ad un certo punto.

Luciferasi batterica

Anche la reazione catalizzata dalla luciferasi batterica è un processo ossidativo:

  • FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + luce

Nella reazione, l'ossigeno molecolare ossida il mononucleotide flavina e un'aldeide alifatica a catena lunga in un acido carbossilico alifatico . La reazione forma un intermedio idrossiflavina eccitato, che viene disidratato al prodotto FMN per emettere luce blu-verde.

Quasi tutta l'energia immessa nella reazione viene trasformata in luce. La reazione è efficiente dall'80% al 90%. In confronto, la lampadina a incandescenza converte solo circa il 10% della sua energia in luce e un LED da 150 lumen per Watt (lm/W) converte il 20% dell'energia in ingresso in luce visibile.

Applicazioni

Le luciferasi possono essere prodotte in laboratorio attraverso l'ingegneria genetica per una serie di scopi. I geni della luciferasi possono essere sintetizzati e inseriti negli organismi o trasfettati nelle cellule. A partire dal 2002, topi , bachi da seta e patate sono solo alcuni degli organismi che sono già stati progettati per produrre la proteina.

Nella reazione della luciferasi, la luce viene emessa quando la luciferasi agisce sul substrato della luciferina appropriato . L'emissione di fotoni può essere rilevata da apparecchi sensibili alla luce come un luminometro o microscopi ottici modificati . Ciò consente l'osservazione dei processi biologici. Poiché l'eccitazione della luce non è necessaria per la bioluminescenza della luciferasi, c'è un'autofluorescenza minima e quindi una fluorescenza praticamente priva di sfondo. Pertanto, un minimo di 0,02 pg può ancora essere misurato con precisione utilizzando un contatore a scintillazione standard .

Nella ricerca biologica, la luciferasi è comunemente usata come reporter per valutare l' attività trascrizionale nelle cellule che sono trasfettate con un costrutto genetico contenente il gene della luciferasi sotto il controllo di un promotore di interesse. Inoltre, le molecole proluminescenti che vengono convertite in luciferina in seguito all'attività di un particolare enzima possono essere utilizzate per rilevare l'attività enzimatica in saggi di luciferasi accoppiati o in due fasi. Tali substrati sono stati utilizzati per rilevare l' attività della caspasi e l'attività del citocromo P450 , tra gli altri.

La luciferasi può anche essere utilizzata per rilevare il livello di ATP cellulare nei saggi di vitalità cellulare o per i saggi di attività della chinasi. La luciferasi può agire come una proteina sensore di ATP attraverso la biotinilazione . La biotinilazione immobilizzerà la luciferasi sulla superficie cellulare legandosi a un complesso streptavidina - biotina . Ciò consente alla luciferasi di rilevare l'efflusso di ATP dalla cellula e mostrerà efficacemente il rilascio in tempo reale di ATP attraverso la bioluminescenza. Luciferasi può inoltre essere reso più sensibile per la rilevazione di ATP aumentando l'intensità di luminescenza modificando alcuni amminoacidi residui nella sequenza della proteina.

L'imaging dell'intero animale (denominato in vivo quando in vita o, altrimenti chiamato imaging ex vivo ) è una tecnica potente per studiare le popolazioni cellulari negli animali vivi, come i topi. Diversi tipi di cellule (ad es. cellule staminali del midollo osseo, cellule T) possono essere ingegnerizzati per esprimere una luciferasi consentendo la loro visualizzazione non invasiva all'interno di un animale vivo utilizzando una fotocamera con dispositivo a coppia di carica sensibile ( camera CCD ). Questa tecnica è stata utilizzata seguire la tumorigenesi e la risposta dei tumori al trattamento in modelli animali. Tuttavia, i fattori ambientali e le interferenze terapeutiche possono causare alcune discrepanze tra il carico tumorale e l'intensità della bioluminescenza in relazione ai cambiamenti nell'attività proliferativa. L'intensità del segnale misurata dall'imaging in vivo può dipendere da vari fattori, come l'assorbimento della D-luciferina attraverso il peritoneo, il flusso sanguigno, la permeabilità della membrana cellulare, la disponibilità di cofattori, il pH intracellulare e la trasparenza del tessuto sovrastante, oltre a la quantità di luciferasi.

La luciferasi è una proteina termosensibile che viene utilizzata negli studi sulla denaturazione delle proteine , testando le capacità protettive delle proteine ​​da shock termico . Le opportunità per l'utilizzo della luciferasi continuano ad espandersi.

Guarda anche

Riferimenti

link esterno

Questo articolo incorpora testo di pubblico dominio Pfam e InterPro : IPR018804
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