Microtomo - Microtome

Un microtomo (dal greco mikros , che significa "piccolo", e temnein , che significa "tagliare") è uno strumento da taglio utilizzato per produrre fette di materiale estremamente sottili note come sezioni . Importanti nella scienza , i microtomi vengono utilizzati in microscopia , consentendo la preparazione di campioni per l'osservazione sotto luce trasmessa o radiazione elettronica .

I microtomi utilizzano lame in acciaio , vetro o diamantate a seconda del campione da affettare e dello spessore desiderato delle sezioni da tagliare. Le lame in acciaio vengono utilizzate per preparare sezioni istologiche di tessuti animali o vegetali per la microscopia ottica . I coltelli di vetro vengono utilizzati per affettare sezioni per la microscopia ottica e per affettare sezioni molto sottili per la microscopia elettronica . I coltelli diamantati di qualità industriale vengono utilizzati per affettare materiali duri come ossa , denti e materiale vegetale resistente sia per la microscopia ottica che per la microscopia elettronica. I coltelli diamantati di qualità gemma vengono utilizzati anche per affettare sezioni sottili per la microscopia elettronica .

La microtomia è un metodo per la preparazione di sezioni sottili per materiali come ossa, minerali e denti e un'alternativa all'elettrolucidatura e alla fresatura ionica . Le sezioni del microtomo possono essere rese abbastanza sottili da sezionare un capello umano per tutta la sua larghezza, con uno spessore della sezione compreso tra 50  nm e 100  μm .

Storia

Un diagramma di un microtomo disegnato da Cummings nel 1770.

All'inizio dello sviluppo del microscopio ottico , le sezioni di piante e animali venivano preparate manualmente utilizzando lamette da barba. Si è riscontrato che per osservare la struttura del campione in osservazione era importante eseguire tagli netti e riproducibili dell'ordine di 100 μm, attraverso i quali la luce può essere trasmessa. Ciò ha consentito l'osservazione di campioni utilizzando microscopi ottici in modalità di trasmissione.

Uno dei primi dispositivi per la preparazione di tali tagli fu inventato nel 1770 da George Adams, Jr. (1750-1795) e ulteriormente sviluppato da Alexander Cummings . Il dispositivo era azionato a mano e il campione era contenuto in un cilindro e sezioni create dalla parte superiore del campione utilizzando una manovella.

Nel 1835, Andrew Prichard sviluppò un modello basato su tavolo che consentiva di isolare le vibrazioni fissando il dispositivo al tavolo, separando l'operatore dal coltello.

Occasionalmente, l'attribuzione per l'invenzione del microtomo è data all'anatomista Wilhelm His, Sr. (1865), Nel suo Beschreibung eines Mikrotoms (tedesco per la descrizione di un microtomo ), Wilhelm scrisse:

L'apparato ha permesso una precisione nel lavoro con la quale posso realizzare sezioni che a mano non posso assolutamente creare. Vale a dire ha permesso la possibilità di ottenere sezioni ininterrotte di oggetti nel corso della ricerca.

Altre fonti attribuiscono ulteriormente lo sviluppo a un fisiologo ceco Jan Evangelista Purkyně . Diverse fonti descrivono il modello Purkyne come il primo in uso pratico.

Le oscurità nelle origini del microtomo sono dovute al fatto che i primi microtomi erano semplicemente apparati da taglio, e la fase di sviluppo dei primi dispositivi è ampiamente non documentata.

Alla fine del 1800, lo sviluppo di campioni molto sottili e costantemente sottili mediante microtomia, insieme alla colorazione selettiva di importanti componenti cellulari o molecole, consentirono la visualizzazione dei dettagli del microscopio.

Oggi, la maggior parte dei microtomi ha un design a blocco coltelli con un coltello intercambiabile, un portacampione e un meccanismo di avanzamento. Nella maggior parte dei dispositivi, il taglio del campione inizia spostando il campione sul coltello, dove il meccanismo di avanzamento si sposta automaticamente in avanti in modo da poter eseguire il taglio successivo per uno spessore prescelto. Lo spessore della sezione è controllato da un meccanismo di regolazione, che consente un controllo preciso.

Applicazioni

Microtomo (C. Reichert, Vienna, 1905-1915).

Le applicazioni più comuni dei microtomi sono:

  • Tecnica istologica tradizionale : i tessuti vengono fissati, disidratati, purificati e inclusi in paraffina fusa , che una volta raffreddata forma un blocco solido. Il tessuto viene quindi tagliato nel microtomo a spessori variabili da 2 a 50 μm. Da lì il tessuto può essere montato su un vetrino da microscopio, colorato con appropriati coloranti acquosi dopo la rimozione della paraffina ed esaminato utilizzando un microscopio ottico.
  • Procedura della sezione congelata : i tessuti ricchi di acqua vengono induriti mediante congelamento e tagliati allo stato congelato con un microtomo di congelamento o un microtomo- criostato ; le sezioni vengono colorate ed esaminate al microscopio ottico. Questa tecnica è molto più veloce dell'istologia tradizionale (5 minuti contro 16 ore) e viene utilizzata insieme a procedure mediche per ottenere una diagnosi rapida. Le criosezioni possono essere utilizzate anche in immunoistochimica poiché il congelamento del tessuto arresta la degradazione del tessuto più velocemente rispetto all'utilizzo di un fissativo e non altera o maschera altrettanto la sua composizione chimica.
  • Tecnica di microscopia elettronica : dopo aver incorporato i tessuti nella resina epossidica, viene utilizzato un microtomo dotato di un coltello diamantato di qualità gemma o di vetro per tagliare sezioni molto sottili (tipicamente da 60 a 100 nanometri). Le sezioni vengono colorate con una soluzione acquosa di un opportuno sale di metalli pesanti ed esaminate con un microscopio elettronico a trasmissione . Questo strumento è spesso chiamato ultramicrotomo . L'ultramicrotomo viene anche utilizzato con il suo coltello di vetro o un coltello diamantato di qualità industriale per tagliare sezioni di rilievo prima del sezionamento sottile. Queste sezioni di indagine hanno generalmente uno spessore da 0,5 a 1 μm e sono montate su un vetrino e colorate per individuare le aree di interesse al microscopio ottico prima del sezionamento sottile per il TEM. Il sezionamento sottile per il TEM viene spesso eseguito con un coltello diamantato di qualità gemma. A complemento delle tradizionali tecniche TEM, gli ultramicrotomi si trovano sempre più spesso montati all'interno di una camera SEM in modo che la superficie della faccia del blocco possa essere visualizzata e quindi rimossa con il microtomo per scoprire la superficie successiva per l'imaging. Questa tecnica è chiamata Microscopia Elettronica a Scansione Serial Block-Face (SBFSEM).
  • Tecnica di microtomia botanica: materiali duri come legno, osso e pelle richiedono un microtomo a slitta . Questi microtomi hanno lame più pesanti e non possono tagliare sottili come un normale microtomo.
  • Spettroscopia (soprattutto spettroscopia FTIR o Infrarossa ) Tecnica: sono necessarie sezioni sottili di polimero affinché il raggio infrarosso penetri nel campione in esame. È normale tagliare campioni con uno spessore compreso tra 20 e 100 μm. Per un'analisi più dettagliata di aree molto più piccole in una sezione sottile, è possibile utilizzare la microscopia FTIR per l'ispezione dei campioni.

Uno sviluppo recente è il microtomo laser , che taglia il campione target con un laser a femtosecondi invece di un coltello meccanico. Questo metodo è senza contatto e non richiede tecniche di preparazione del campione. Il microtomo laser ha la capacità di affettare quasi ogni tessuto nel suo stato nativo. A seconda del materiale da lavorare, sono possibili spessori di fetta da 10 a 100 μm.

Gli intervalli di sezionamento possono essere classificati principalmente in:

  • Sezionamento seriale: ricavare un nastro continuo di sezioni da un blocco di paraffina e utilizzarle tutte per i vetrini.
  • Sezioni di gradini: raccolte a profondità specificate nel blocco.

tipi

Slitta

Un microtomo a slitta

Un microtomo a slitta è un dispositivo in cui il campione viene posto in un supporto fisso (navetta), che poi si muove avanti e indietro attraverso un coltello. I moderni microtomi a slitta hanno la slitta posizionata su un cuscinetto lineare, un design che consente al microtomo di tagliare facilmente molte sezioni grossolane. Regolando gli angoli tra il campione e la lama del microtomo, è possibile ridurre la pressione applicata al campione durante il taglio. Applicazioni tipiche per questo progetto di microtomo sono la preparazione di campioni di grandi dimensioni, come quelli inclusi in paraffina per preparazioni biologiche. Lo spessore di taglio tipico ottenibile su un microtomo a slitta è compreso tra 1 e 60 μm.

Rotante

Un microtomo rotante di vecchia costruzione

Questo strumento è un modello comune di microtomo. Questo dispositivo funziona con un'azione rotatoria graduale in modo tale che il taglio effettivo sia parte del movimento rotatorio. In un microtomo rotante, il coltello è tipicamente fissato in posizione orizzontale.

Principio del movimento del campione per eseguire un taglio su un microtomo rotante

Nella figura a sinistra viene spiegato il principio del taglio. Attraverso il movimento del portacampione, il campione viene tagliato dalla posizione del coltello 1 alla posizione 2, a quel punto la sezione fresca rimane sul coltello. Nel punto più alto del moto rotatorio, il portacampione viene fatto avanzare dello stesso spessore della sezione che si vuole realizzare, permettendo di realizzare la sezione successiva.

Il volano in molti microtomi può essere azionato a mano. Ciò ha il vantaggio di poter eseguire un taglio netto, poiché la massa relativamente grande del volano impedisce l'arresto del campione durante il taglio del campione. Il volano nei modelli più recenti è spesso integrato all'interno dell'involucro del microtomo. Lo spessore di taglio tipico per un microtomo rotante è compreso tra 1 e 60 μm. Per materiali duri, come un campione incorporato in una resina sintetica, questo design del microtomo può consentire buone sezioni "semi-sottili" con uno spessore di appena 0,5 μm.

criomicrotomo

Un criomicrotomo

Per il taglio di campioni congelati, molti microtomi rotanti possono essere adattati per il taglio in una camera ad azoto liquido, in una cosiddetta configurazione criomicrotomica. La temperatura ridotta consente di aumentare la durezza del campione, ad esempio subendo una transizione vetrosa, che consente la preparazione di campioni semisottili. Tuttavia, la temperatura del campione e la temperatura del coltello devono essere controllate per ottimizzare lo spessore del campione risultante.

Ultramicrotomo

Un nastro di sezioni ultrasottili preparato mediante ultramicrotomia a temperatura ambiente, che galleggia sull'acqua nella barca di un coltello diamantato utilizzato per tagliare le sezioni. La lama del coltello è il bordo all'estremità superiore del trogolo d'acqua.

Un ultramicrotomo è uno strumento principale dell'ultramicrotomia . Consente la preparazione di sezioni estremamente sottili, con il dispositivo funzionante allo stesso modo di un microtomo rotazionale, ma con tolleranze molto strette sulla costruzione meccanica. Come risultato dell'attenta costruzione meccanica, l'espansione termica lineare del montaggio viene utilizzata per fornire un controllo molto fine dello spessore.

Questi tagli estremamente sottili sono importanti per l'uso con il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) e talvolta sono importanti anche per la microscopia ottica ottica. Lo spessore tipico di questi tagli è compreso tra 40 e 100 nm per la microscopia elettronica a trasmissione e spesso tra 30 e 50 nm per SBFSEM. Sezioni più spesse fino a 500 nm vengono anche prese per applicazioni TEM specializzate o per sezioni di rilevamento di microscopia ottica per selezionare un'area per le sezioni sottili finali. Coltelli diamantati (preferibilmente) e coltelli di vetro sono usati con gli ultramicrotomi. Per raccogliere le sezioni, vengono fatte galleggiare sopra un liquido mentre vengono tagliate e vengono raccolte con cura su griglie adatte alla visualizzazione dei campioni TEM. Lo spessore della sezione può essere stimato dai colori di interferenza del film sottile della luce riflessa che si vedono come risultato dello spessore estremamente basso del campione.

vibrante

Il microtomo vibrante funziona tagliando con una lama vibrante, consentendo di eseguire il taglio risultante con una pressione inferiore a quella necessaria per una lama fissa. Il microtomo vibrante viene solitamente utilizzato per campioni biologici difficili. Lo spessore del taglio è solitamente di circa 30-500 μm per il tessuto vivo e 10-500 μm per il tessuto fisso.

Una variante del microtomo vibrante è il microtomo Compresstome. Il Compresstome utilizza una siringa per campioni o un tubo "simile a un rossetto" per trattenere il tessuto. Il campione di tessuto è completamente immerso in agarosio (un polisaccaride ) e il tessuto viene lentamente e delicatamente premuto fuori dal tubo per il taglio della lama vibrante. Il dispositivo funziona nel seguente modo: l'estremità del tubo campione dove fuoriesce il tessuto è leggermente più stretta dell'estremità di caricamento, il che consente una delicata "compressione" del tessuto mentre fuoriesce dal tubo. La leggera compressione impedisce la formazione di artefatti da taglio, taglio irregolare e vibrazioni. Si noti che la tecnologia di compressione non danneggia o influenza il tessuto da sezionare.

Ci sono diversi vantaggi del microtomo Compresstome: 1) l'inclusione di agarosio fornisce stabilità all'intero campione su tutti i lati, che impedisce il taglio irregolare o il taglio del tessuto; 2) la tecnologia di compressione comprime delicatamente il tessuto per un taglio uniforme, in modo che la lama non spinga contro il tessuto; 3) sezionamento più veloce rispetto alla maggior parte dei microtomi vibranti; e 4) taglia bene i tessuti degli animali più vecchi o più maturi per fornire tessuti più sani.

Sega

Il microtomo a sega è particolarmente adatto per materiali duri come denti o ossa. Il microtomo di questo tipo ha una sega rotante incassata, che taglia il campione. Lo spessore di taglio minimo è di circa 30 μm e può essere realizzato per campioni relativamente grandi.

Laser

Un diagramma concettuale del funzionamento del microtomo laser

Il microtomo laser è uno strumento per affettare senza contatto. Non è richiesta la preparazione preliminare del campione mediante inclusione, congelamento o fissazione chimica , riducendo così al minimo gli artefatti derivanti dai metodi di preparazione. In alternativa, questo modello di microtomo può essere utilizzato anche per materiali molto duri, come ossa o denti, nonché alcune ceramiche. A seconda delle proprietà del materiale campione, lo spessore ottenibile è compreso tra 10 e 100 μm.

Il dispositivo funziona utilizzando un'azione di taglio di un laser a infrarossi. Poiché il laser emette una radiazione nel vicino infrarosso, in questo regime di lunghezze d'onda il laser può interagire con i materiali biologici. Attraverso una messa a fuoco precisa della sonda all'interno del campione, è possibile ottenere un punto focale di intensità molto elevata, fino a TW /cm 2 . Attraverso l'interazione non lineare della penetrazione ottica nella regione focale viene introdotta una separazione di materiale in un processo noto come foto-interruzione. Limitando la durata dell'impulso laser all'intervallo di femtosecondi, l'energia spesa nella regione target viene controllata con precisione, limitando così la zona di interazione del taglio a meno di un micrometro. All'esterno di questa zona, il tempo di applicazione del raggio ultra-corto introduce danni termici minimi o nulli al resto del campione.

La radiazione laser è diretta su un sistema ottico a specchio a scansione rapida, che consente il posizionamento tridimensionale del crossover del raggio, consentendo al contempo l'attraversamento del raggio nella regione di interesse desiderata. La combinazione di alta potenza con un'elevata velocità raster consente allo scanner di tagliare ampie aree di campione in breve tempo. Nel microtomo laser è anche possibile la microdissezione laser di aree interne in tessuti, strutture cellulari e altri tipi di piccole caratteristiche.

coltelli

Una lama di coltello diamantata utilizzata per il taglio di sezioni ultrasottili (tipicamente da 70 a 350 nm) per la microscopia elettronica a trasmissione.
Il tagliente di una lama usa e getta per un microtomo al microscopio.

La scelta del profilo della lama del coltello del microtomo dipende dal materiale e dalla preparazione dei campioni, nonché dai requisiti del campione finale (ad es. spessore e qualità del taglio).

Tipi di disegno e taglio

Profili di coltelli da microtomo.

Generalmente i coltelli sono caratterizzati dal profilo della lama del coltello, che rientra nelle categorie dei disegni planari concavi, a cuneo o a scalpello.

I coltelli planari concavi del microtomo sono estremamente affilati, ma sono anche molto delicati e vengono quindi utilizzati solo con campioni molto morbidi. I coltelli con profilo a cuneo sono un po' più stabili e trovano impiego in materiali moderatamente duri, come nel taglio di campioni epossidici o criogenici. Infine, il profilo dello scalpello con il suo bordo smussato, aumenta la stabilità del coltello, pur richiedendo una forza significativamente maggiore per ottenere il taglio.

Per gli ultramicrotomi sono necessari coltelli in vetro e diamantati, la larghezza di taglio della lama è quindi dell'ordine di pochi millimetri ed è quindi notevolmente inferiore rispetto ai classici coltelli da microtomo. I coltelli di vetro sono solitamente prodotti dalla frattura di barre di vetro utilizzando speciali dispositivi di frattura "coltello". Le lame di vetro possono essere utilizzate per la preparazione iniziale del campione anche laddove le lame diamantate possono essere utilizzate per il sezionamento finale. I coltelli di vetro di solito hanno piccole vaschette, realizzate con nastro di plastica, che vengono riempite d'acqua per consentire al campione di galleggiare per una successiva raccolta. Le lame diamantate possono essere integrate in un tale trogolo esistente, consentendo lo stesso metodo di raccolta.

Sezionando

Prima del taglio al microtomo, i materiali biologici vengono solitamente inseriti in un fissativo più rigido, in un processo noto come inclusione. Ciò è ottenuto dall'afflusso di una sostanza liquida attorno al campione, come paraffina (cera) o resina epossidica, che viene posta in uno stampo e successivamente indurita per produrre un "blocco" che viene facilmente tagliato.

La declinazione è l'angolo di contatto tra la verticale del campione e la lama del coltello. Se la lama del coltello è ad angolo retto (declinazione=90) il taglio viene effettuato direttamente utilizzando una modalità basata sulla pressione, e le forze sono quindi proporzionalmente maggiori. Se il coltello è inclinato, tuttavia, il movimento relativo del coltello è sempre più parallelo al movimento del campione, consentendo un'azione di taglio. Questo comportamento è molto importante per campioni grandi o duri

L'inclinazione del coltello è l'angolo tra la faccia del coltello e il campione. Per un risultato ottimale, questo angolo deve essere scelto in modo appropriato. L'angolo ottimale dipende dalla geometria del coltello, dalla velocità di taglio e da molti altri parametri. Se l'angolo viene regolato a zero, il taglio del coltello può spesso diventare irregolare e per appianare questo è necessario utilizzare una nuova posizione del coltello.

Se l'angolo è troppo grande, il campione può accartocciarsi e il coltello può indurre variazioni periodiche di spessore nel taglio. Aumentando ulteriormente l'angolo in modo che sia troppo grande si può danneggiare la lama stessa del coltello.

Guarda anche

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