Microscopio ottico - Optical microscope
Il microscopio ottico , detto anche microscopio ottico , è un tipo di microscopio che utilizza comunemente la luce visibile e un sistema di lenti per generare immagini ingrandite di piccoli oggetti. I microscopi ottici sono il modello più antico di microscopio e sono stati probabilmente inventati nella loro attuale forma composta nel XVII secolo. I microscopi ottici di base possono essere molto semplici, sebbene molti progetti complessi mirino a migliorare la risoluzione e il contrasto del campione .
L'oggetto viene posizionato su un tavolino e può essere visualizzato direttamente attraverso uno o due oculari al microscopio. Nei microscopi ad alta potenza, entrambi gli oculari in genere mostrano la stessa immagine, ma con uno stereomicroscopio vengono utilizzate immagini leggermente diverse per creare un effetto 3D. Una fotocamera viene in genere utilizzata per catturare l'immagine ( micrografia ).
Il campione può essere acceso in vari modi. Gli oggetti trasparenti possono essere illuminati dal basso e gli oggetti solidi possono essere illuminati con luce che passa attraverso ( campo chiaro ) o intorno ( campo scuro ) alla lente dell'obiettivo. La luce polarizzata può essere utilizzata per determinare l'orientamento dei cristalli di oggetti metallici. L'imaging a contrasto di fase può essere utilizzato per aumentare il contrasto dell'immagine evidenziando piccoli dettagli del diverso indice di rifrazione.
Una gamma di obiettivi con diversi ingrandimenti viene solitamente fornita montata su una torretta, consentendo loro di essere ruotati in posizione e fornendo la possibilità di ingrandire. Il potere di ingrandimento massimo dei microscopi ottici è tipicamente limitato a circa 1000x a causa del limitato potere di risoluzione della luce visibile. L'ingrandimento di un microscopio ottico composto è il prodotto dell'ingrandimento dell'oculare (diciamo 10x) e della lente dell'obiettivo (diciamo 100x), per dare un ingrandimento totale di 1.000×. Ambienti modificati come l'uso di olio o luce ultravioletta possono aumentare l'ingrandimento.
Alternative al microscopio ottico che non utilizzano la luce visibile includono microscopia elettronica a scansione e la microscopia elettronica a trasmissione e microscopia a scansione sonda e, di conseguenza, può raggiungere ingrandimenti maggiori tanto.
tipi
Esistono due tipi fondamentali di microscopi ottici: microscopi semplici e microscopi composti. Un microscopio semplice utilizza la potenza ottica di una singola lente o di un gruppo di lenti per l'ingrandimento. Un microscopio composto utilizza un sistema di lenti (un insieme ingrandisce l'immagine prodotta da un altro) per ottenere un ingrandimento molto più elevato di un oggetto. La stragrande maggioranza dei moderni microscopi di ricerca sono microscopi composti, mentre alcuni microscopi digitali commerciali più economici sono semplici microscopi a lente singola. I microscopi composti possono essere ulteriormente suddivisi in una varietà di altri tipi di microscopi che differiscono per configurazioni ottiche, costi e scopi previsti.
Microscopio semplice
Un semplice microscopio utilizza una lente o un set di lenti per ingrandire un oggetto attraverso il solo ingrandimento angolare, dando allo spettatore un'immagine virtuale ingrandita eretta . L'uso di una singola lente convessa o di gruppi di lenti si riscontra in semplici dispositivi di ingrandimento come la lente d'ingrandimento , gli occhialini e gli oculari per telescopi e microscopi.
Microscopio composto
Un microscopio composto utilizza una lente vicino all'oggetto di essere letta alla luce raccolta (chiamato oggettivo lente) che focalizza un immagine reale dell'oggetto all'interno del microscopio (figura 1). Quell'immagine viene quindi ingrandita da una seconda lente o gruppo di lenti (chiamato oculare ) che fornisce allo spettatore un'immagine virtuale ingrandita invertita dell'oggetto (immagine 2). L'uso di una combinazione obiettivo/oculare composto consente un ingrandimento molto più elevato. I comuni microscopi composti sono spesso dotati di obiettivi intercambiabili, che consentono all'utente di regolare rapidamente l'ingrandimento. Un microscopio composto consente anche configurazioni di illuminazione più avanzate, come il contrasto di fase .
Altre varianti di microscopio
Esistono molte varianti del design del microscopio ottico composto per scopi specializzati. Alcune di queste sono differenze di progettazione fisica che consentono la specializzazione per determinati scopi:
- Stereomicroscopio , un microscopio a bassa potenza che fornisce una visione stereoscopica del campione, comunemente usato per la dissezione.
- Microscopio di confronto , che ha due percorsi luminosi separati che consentono il confronto diretto di due campioni tramite un'immagine in ciascun occhio.
- Microscopio invertito , per lo studio di campioni dal basso; utile per colture cellulari in liquido, o per metallografia.
- Microscopio per l'ispezione del connettore in fibra ottica, progettato per l'ispezione dell'estremità del connettore
- Microscopio da viaggio , per lo studio di campioni ad alta risoluzione ottica .
Altre varianti di microscopio sono progettate per diverse tecniche di illuminazione:
- Microscopio petrografico , il cui design di solito include un filtro polarizzatore, un tavolino rotante e una lastra di gesso per facilitare lo studio di minerali o altri materiali cristallini le cui proprietà ottiche possono variare con l'orientamento.
- Microscopio polarizzatore , simile al microscopio petrografico.
- Microscopio a contrasto di fase , che applica il metodo di illuminazione a contrasto di fase.
- Microscopio a epifluorescenza , progettato per l'analisi di campioni che includono fluorofori.
- Microscopio confocale , una variante ampiamente utilizzata dell'illuminazione epifluorescente che utilizza un laser a scansione per illuminare un campione per la fluorescenza.
- Microscopio a due fotoni , utilizzato per visualizzare la fluorescenza più in profondità nei mezzi di diffusione e ridurre il fotosbiancamento, specialmente nei campioni viventi.
- Microscopio per studenti: un microscopio spesso a bassa potenza con controlli semplificati e talvolta ottiche di bassa qualità progettati per l'uso scolastico o come strumento di partenza per i bambini.
- Ultramicroscopio , un microscopio ottico adattato che utilizza la diffusione della luce per consentire la visualizzazione di minuscole particelle il cui diametro è inferiore o vicino alla lunghezza d'onda della luce visibile (circa 500 nanometri); per lo più obsoleti dall'avvento dei microscopi elettronici
- Il microscopio Raman con punta avanzata , è una variante del microscopio ottico basato sulla spettroscopia Raman con punta avanzata , senza limiti di risoluzione tradizionali basati sulla lunghezza d'onda. Questo microscopio è stato realizzato principalmente sulle piattaforme di microscopio a scansione di sonda utilizzando tutti gli strumenti ottici.
Microscopio digitale
Un microscopio digitale è un microscopio dotato di una fotocamera digitale che consente l'osservazione di un campione tramite un computer . I microscopi possono anche essere parzialmente o totalmente controllati da computer con vari livelli di automazione. La microscopia digitale consente una maggiore analisi di un'immagine al microscopio, ad esempio misurazioni di distanze e aree e quantificazione di una macchia fluorescente o istologica .
Sono disponibili in commercio anche microscopi digitali a bassa potenza, microscopi USB . Si tratta essenzialmente di webcam con un obiettivo macro ad alta potenza e generalmente non utilizzano la transilluminazione . La fotocamera collegata direttamente alla porta USB di un computer in modo che le immagini vengano visualizzate direttamente sul monitor. Offrono ingrandimenti modesti (fino a circa 200×) senza la necessità di utilizzare oculari, e a costi molto contenuti. L'illuminazione ad alta potenza è solitamente fornita da una sorgente LED o da sorgenti adiacenti all'obiettivo della telecamera.
La microscopia digitale con livelli di luce molto bassi per evitare danni ai campioni biologici vulnerabili è disponibile utilizzando fotocamere digitali sensibili al conteggio dei fotoni . È stato dimostrato che una sorgente luminosa che fornisce coppie di fotoni entangled può ridurre al minimo il rischio di danni ai campioni più sensibili alla luce. In questa applicazione dell'imaging fantasma alla microscopia a fotoni sparsa, il campione è illuminato con fotoni infrarossi, ciascuno dei quali è correlato spazialmente con un partner entangled nella banda visibile per l'imaging efficiente da una fotocamera per il conteggio dei fotoni.
Storia
Invenzione
I primi microscopi erano lenti d' ingrandimento a lente singola con ingrandimento limitato che risalgono almeno all'uso diffuso di lenti negli occhiali nel XIII secolo.
I microscopi composti sono apparsi per la prima volta in Europa intorno al 1620, tra cui uno dimostrato da Cornelis Drebbel a Londra (intorno al 1621) e uno esposto a Roma nel 1624.
L'effettivo inventore del microscopio composto è sconosciuto sebbene siano state fatte molte affermazioni nel corso degli anni. Questi includono un'affermazione 35 anni dopo la loro comparsa da parte del produttore di occhiali olandese Johannes Zachariassen che suo padre, Zacharias Janssen , inventò il microscopio composto e/o il telescopio già nel 1590. La testimonianza di Johannes (alcuni sostengono dubbia) spinge la data dell'invenzione così molto tempo fa che Zaccaria sarebbe stato un bambino all'epoca, portando alla speculazione che, affinché l'affermazione di Johannes fosse vera, il microscopio composto avrebbe dovuto essere stato inventato dal nonno di Johannes, Hans Martens. Un'altra affermazione è che il concorrente di Janssen, Hans Lippershey (che fece domanda per il primo brevetto del telescopio nel 1608) inventò anche il microscopio composto. Altri storici indicano l'innovatore olandese Cornelis Drebbel con il suo microscopio composto del 1621.
Galileo Galilei è talvolta citato anche come inventore del microscopio composto. Dopo il 1610, scoprì che poteva mettere a fuoco da vicino il suo telescopio per vedere piccoli oggetti, come le mosche, da vicino e/o poteva guardare attraverso l'estremità sbagliata al contrario per ingrandire piccoli oggetti. L'unico inconveniente era che il suo telescopio lungo 2 piedi doveva essere esteso a 6 piedi per vedere gli oggetti che si avvicinavano. Dopo aver visto il microscopio composto costruito da Drebbel esposto a Roma nel 1624, Galileo ne costruì una propria versione migliorata. Nel 1625 Giovanni Faber coniò il nome microscopio per il microscopio composto che Galileo presentò all'Accademia dei Lincei nel 1624 (Galileo lo aveva chiamato " occhiolino " o " piccolo occhio "). Faber ha coniato il nome dalle parole greche μικρόν (micron) che significa "piccolo", e σκοπεῖν (skopein) che significa "guardare", nome che vuole essere analogo a " telescopio ", altra parola coniata dai Lincei.
Christiaan Huygens , un altro olandese, sviluppò un semplice sistema oculare a 2 lenti alla fine del XVII secolo che fu corretto acromaticamente , e quindi un enorme passo avanti nello sviluppo del microscopio. L'oculare Huygens è ancora in produzione fino ad oggi, ma soffre di una piccola dimensione del campo e di altri svantaggi minori.
divulgazione
Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) è accreditato per aver portato il microscopio all'attenzione dei biologi, anche se semplici lenti di ingrandimento erano già state prodotte nel XVI secolo. I microscopi fatti in casa di Van Leeuwenhoek erano semplici microscopi, con un'unica lente molto piccola, ma forte. Erano scomodi da usare, ma consentivano a van Leeuwenhoek di vedere immagini dettagliate. Ci sono voluti circa 150 anni di sviluppo ottico prima che il microscopio composto fosse in grado di fornire la stessa qualità di immagine dei microscopi semplici di van Leeuwenhoek, a causa delle difficoltà nella configurazione di più lenti. Nel 1850, John Leonard Riddell , professore di chimica alla Tulane University , inventò il primo microscopio binoculare pratico mentre conduceva una delle prime e più estese indagini microscopiche americane sul colera .
Tecniche di illuminazione
Sebbene la tecnologia e l'ottica di base del microscopio siano disponibili da oltre 400 anni, è molto più recentemente che sono state sviluppate tecniche di illuminazione del campione per generare le immagini di alta qualità viste oggi.
Nell'agosto 1893, August Köhler sviluppò l' illuminazione Köhler . Questo metodo di illuminazione del campione dà luogo a un'illuminazione estremamente uniforme e supera molte limitazioni delle vecchie tecniche di illuminazione del campione. Prima dello sviluppo dell'illuminazione Köhler, l'immagine della sorgente luminosa, ad esempio il filamento di una lampadina , era sempre visibile nell'immagine del campione.
Il premio Nobel per la fisica è stato assegnato al fisico olandese Frits Zernike nel 1953 per il suo sviluppo dell'illuminazione a contrasto di fase che consente l'imaging di campioni trasparenti. Utilizzando l' interferenza anziché l' assorbimento della luce, è possibile acquisire immagini di campioni estremamente trasparenti, come le cellule di mammiferi vivi , senza dover utilizzare tecniche di colorazione. Solo due anni dopo, nel 1955, Georges Nomarski pubblicò la teoria per la microscopia a contrasto di interferenza differenziale , un'altra tecnica di imaging basata sull'interferenza .
Microscopia a fluorescenza
La moderna microscopia biologica dipende fortemente dallo sviluppo di sonde fluorescenti per strutture specifiche all'interno di una cellula. Contrariamente alla normale microscopia ottica transilluminata, nella microscopia a fluorescenza il campione è illuminato attraverso la lente dell'obiettivo con un insieme ristretto di lunghezze d'onda della luce. Questa luce interagisce con i fluorofori nel campione che poi emettono luce di una lunghezza d'onda maggiore . È questa luce emessa che costituisce l'immagine.
Dalla metà del XX secolo, le colorazioni chimiche fluorescenti, come il DAPI che si lega al DNA , sono state utilizzate per etichettare strutture specifiche all'interno della cellula. Gli sviluppi più recenti includono l' immunofluorescenza , che utilizza anticorpi marcati con fluorescenza per riconoscere proteine specifiche all'interno di un campione e proteine fluorescenti come la GFP che una cellula viva può esprimere rendendola fluorescente.
Componenti
Tutti i moderni microscopi ottici progettati per la visualizzazione di campioni mediante luce trasmessa condividono gli stessi componenti di base del percorso della luce. Inoltre, la stragrande maggioranza dei microscopi ha gli stessi componenti "strutturali" (numerati di seguito secondo l'immagine a destra):
- Oculare (lente oculare) (1)
- Torretta obiettivo, revolver o nasello girevole (per contenere più obiettivi) (2)
- Lenti obiettive (3)
- Manopole di messa a fuoco (per spostare il palco)
- Regolazione grossolana (4)
- Regolazione fine (5)
- Palco (per contenere il campione) (6)
- Sorgente luminosa (una luce o uno specchio ) (7)
- Membrana e condensatore (8)
- Stadio meccanico (9)
Oculare (lente oculare)
L' oculare , o lente oculare, è un cilindro contenente due o più lenti; la sua funzione è di mettere a fuoco l'immagine per l'occhio. L'oculare è inserito nell'estremità superiore del tubo del corpo. Gli oculari sono intercambiabili e possono essere inseriti molti oculari diversi con diversi gradi di ingrandimento. I valori di ingrandimento tipici per gli oculari includono 5×, 10× (il più comune), 15× e 20×. In alcuni microscopi ad alte prestazioni, la configurazione ottica della lente dell'obiettivo e dell'oculare è abbinata per offrire le migliori prestazioni ottiche possibili. Ciò si verifica più comunemente con obiettivi apocromatici .
Torretta obiettivo (revolver o nasello girevole)
La torretta dell'obiettivo, il revolver o il nasello girevole è la parte che contiene il set di obiettivi. Consente all'utente di passare da un obiettivo all'altro.
Obiettivo
All'estremità inferiore di un tipico microscopio ottico composto, ci sono una o più lenti dell'obiettivo che raccolgono la luce dal campione. L'obiettivo è solitamente in un alloggiamento cilindrico contenente una lente composta in vetro a elemento singolo o multiplo. Tipicamente ci saranno circa tre obiettivi avvitati in un nasello circolare che può essere ruotato per selezionare l'obiettivo richiesto. Queste disposizioni sono progettate per essere parafocali , il che significa che quando si passa da una lente all'altra su un microscopio, il campione rimane a fuoco . Gli obiettivi del microscopio sono caratterizzati da due parametri, vale a dire, ingrandimento e apertura numerica . Il primo varia tipicamente da 5× a 100× mentre il secondo varia da 0,14 a 0,7, corrispondenti a lunghezze focali da circa 40 a 2 mm, rispettivamente. Gli obiettivi con ingrandimenti maggiori normalmente hanno un'apertura numerica maggiore e una profondità di campo minore nell'immagine risultante. Alcuni obiettivi ad alte prestazioni possono richiedere oculari abbinati per fornire le migliori prestazioni ottiche.
Obiettivo a immersione in olio
Alcuni microscopi utilizzano obiettivi ad immersione in olio o obiettivi ad immersione in acqua per una maggiore risoluzione ad alto ingrandimento. Questi vengono utilizzati con materiale di corrispondenza dell'indice come olio per immersione o acqua e un coprioggetto abbinato tra la lente dell'obiettivo e il campione. L'indice di rifrazione del materiale di corrispondenza dell'indice è superiore all'aria consentendo alla lente dell'obiettivo di avere un'apertura numerica più ampia (maggiore di 1) in modo che la luce venga trasmessa dal campione alla faccia esterna della lente dell'obiettivo con una rifrazione minima. È possibile ottenere aperture numeriche fino a 1,6. L'apertura numerica più ampia consente la raccolta di più luce rendendo possibile l'osservazione dettagliata dei dettagli più piccoli. Una lente ad immersione in olio di solito ha un ingrandimento da 40 a 100×.
Manopole di messa a fuoco
Le manopole di regolazione spostano il tavolino su e giù con regolazione separata per una messa a fuoco grossolana e fine. Gli stessi controlli consentono al microscopio di adattarsi a campioni di diverso spessore. Nei vecchi modelli di microscopi, le ruote di regolazione della messa a fuoco spostano il tubo del microscopio in alto o in basso rispetto al supporto e hanno un tavolino fisso.
Portafoto
L'intero gruppo ottico è tradizionalmente fissato ad un braccio rigido, il quale a sua volta è fissato ad un robusto piede ad U per fornire la necessaria rigidità. L'angolo del braccio può essere regolabile per consentire la regolazione dell'angolo di visione.
Il telaio fornisce un punto di montaggio per vari controlli del microscopio. Normalmente questo include i controlli per la messa a fuoco, in genere una grande rotella zigrinata per regolare la messa a fuoco grossolana, insieme a una rotella zigrinata più piccola per controllare la messa a fuoco fine. Altre caratteristiche possono essere i controlli della lampada e/oi controlli per la regolazione del condensatore.
Palcoscenico
Il palco è una piattaforma sotto la lente dell'obiettivo che supporta il campione che viene visualizzato. Al centro del palco c'è un foro attraverso il quale passa la luce per illuminare il campione. Il tavolino è solitamente dotato di bracci per il sostegno dei vetrini (piastre di vetro rettangolari con dimensioni tipiche di 25×75 mm, su cui è montato il provino).
A ingrandimenti superiori a 100× lo spostamento manuale di una diapositiva non è pratico. Un tavolino meccanico, tipico dei microscopi di fascia media e superiore, consente piccoli movimenti del vetrino tramite manopole di controllo che riposizionano il campione/vetrino a piacimento. Se un microscopio originariamente non aveva un tavolino meccanico, potrebbe essere possibile aggiungerne uno.
Tutte le fasi si muovono su e giù per la messa a fuoco. Con un tavolino meccanico le slitte si muovono su due assi orizzontali per posizionare il provino per esaminare i dettagli del provino.
La messa a fuoco inizia a un ingrandimento inferiore per centrare il campione da parte dell'utente sul tavolino. Il passaggio a un ingrandimento maggiore richiede che il tavolino venga spostato più in alto verticalmente per la rimessa a fuoco all'ingrandimento maggiore e potrebbe anche richiedere una leggera regolazione della posizione orizzontale del campione. Le regolazioni della posizione orizzontale del provino sono la ragione per avere un tavolino meccanico.
A causa della difficoltà nel preparare i campioni e nel montarli sui vetrini, per i bambini è meglio iniziare con vetrini preparati che siano centrati e che mettano a fuoco facilmente indipendentemente dal livello di messa a fuoco utilizzato.
Fonte di luce
Possono essere utilizzate molte fonti di luce. Nella sua forma più semplice, la luce del giorno è diretta tramite uno specchio . La maggior parte dei microscopi, tuttavia, dispone di una propria sorgente luminosa regolabile e controllabile, spesso una lampada alogena , sebbene l'illuminazione tramite LED e laser stia diventando una disposizione più comune. L'illuminazione Köhler viene spesso fornita su strumenti più costosi.
Condensatore
Il condensatore è una lente progettata per focalizzare la luce dalla sorgente di illuminazione sul campione. Il condensatore può includere anche altre caratteristiche, come un diaframma e/o filtri, per gestire la qualità e l'intensità dell'illuminazione. Per le tecniche di illuminazione come il campo oscuro , il contrasto di fase e la microscopia a contrasto di interferenza differenziale, i componenti ottici aggiuntivi devono essere allineati con precisione nel percorso della luce.
Ingrandimento
La potenza effettiva o l' ingrandimento di un microscopio ottico composto è il prodotto dei poteri dell'oculare ( oculare ) e della lente dell'obiettivo. Gli ingrandimenti massimi normali dell'oculare e dell'obiettivo sono rispettivamente 10× e 100×, per un ingrandimento finale di 1.000×.
Ingrandimento e micrografie
Quando si utilizza una fotocamera per acquisire una micrografia, l'ingrandimento effettivo dell'immagine deve tenere conto delle dimensioni dell'immagine. Ciò è indipendente dal fatto che si tratti di una stampa da un negativo di pellicola o visualizzato digitalmente sullo schermo di un computer .
Nel caso delle fotocamere a pellicola fotografica il calcolo è semplice; l'ingrandimento finale è il prodotto di: l'ingrandimento della lente dell'obiettivo, l'ingrandimento dell'ottica della fotocamera e il fattore di ingrandimento della stampa della pellicola rispetto al negativo. Un valore tipico del fattore di ingrandimento è di circa 5× (nel caso di una pellicola da 35 mm e una stampa di 15 × 10 cm (6 × 4 pollici).
Nel caso delle fotocamere digitali è necessario conoscere la dimensione dei pixel nel rilevatore CMOS o CCD e la dimensione dei pixel sullo schermo. È quindi possibile calcolare il fattore di ingrandimento dal rilevatore ai pixel sullo schermo. Come con una macchina da presa, l'ingrandimento finale è il prodotto di: l'ingrandimento dell'obiettivo, l'ingrandimento dell'ottica della fotocamera e il fattore di ingrandimento.
operazione
Tecniche di illuminazione
Sono disponibili molte tecniche che modificano il percorso della luce per generare un'immagine di contrasto migliorata da un campione. Le principali tecniche per generare un maggiore contrasto dal campione includono luce polarizzata incrociata , campo oscuro , contrasto di fase e illuminazione a contrasto di interferenza differenziale . Una tecnica recente ( Sarfus ) combina luce polarizzata incrociata e diapositive con contrasto specifico per la visualizzazione di campioni nanometrici.
- Quattro esempi di tecniche di transiluminazione utilizzate per generare contrasto in un campione di carta velina . 1,559 micron/pixel.
Campo chiaro illuminazione, contrasto campione proviene da assorbanza della luce nel campione.
Illuminazione a luce polarizzata incrociata , il contrasto del campione deriva dalla rotazione della luce polarizzata attraverso il campione.
Illuminazione in campo scuro , il contrasto del campione proviene dalla luce diffusa dal campione.
Illuminazione a contrasto di fase , il contrasto del campione deriva dall'interferenza di diverse lunghezze del percorso della luce attraverso il campione.
Altre tecniche
I microscopi moderni consentono più della semplice osservazione dell'immagine a luce trasmessa di un campione; ci sono molte tecniche che possono essere usate per estrarre altri tipi di dati. La maggior parte di questi richiede attrezzature aggiuntive oltre a un microscopio composto di base.
- Luce riflessa, o incidente, illuminazione (per l'analisi delle strutture superficiali)
- Microscopia a fluorescenza, entrambi:
- Microspettroscopia (dove uno spettrofotometro UV-visibile è integrato con un microscopio ottico)
- Microscopia ultravioletta
- Microscopia nel vicino infrarosso
- Microscopia a trasmissione multipla per il miglioramento del contrasto e la riduzione dell'aberrazione.
- Automazione (per la scansione automatica di un campione di grandi dimensioni o per l'acquisizione di immagini)
Applicazioni
La microscopia ottica è ampiamente utilizzata in microelettronica, nanofisica, biotecnologia, ricerca farmaceutica, mineralogia e microbiologia.
La microscopia ottica viene utilizzata per la diagnosi medica , campo che viene chiamato istopatologia quando si tratta di tessuti, o nei test di striscio su cellule libere o frammenti di tessuto.
Nell'uso industriale, i microscopi binoculari sono comuni. A parte le applicazioni che richiedono una reale percezione della profondità , l'uso di doppi oculari riduce l'affaticamento degli occhi associato a lunghe giornate lavorative in una stazione di microscopia. In alcune applicazioni, i microscopi a lunga distanza di lavoro o con messa a fuoco lunga sono utili. Potrebbe essere necessario esaminare un oggetto dietro una finestra oppure i soggetti industriali potrebbero rappresentare un pericolo per l'obiettivo. Tali ottiche assomigliano ai telescopi con capacità di messa a fuoco ravvicinata.
I microscopi di misurazione sono utilizzati per la misurazione di precisione. Ci sono due tipi fondamentali. Uno ha un reticolo graduato per consentire la misurazione delle distanze nel piano focale. L'altro tipo (e più vecchio) ha un semplice mirino e un meccanismo micrometrico per spostare il soggetto rispetto al microscopio.
Microscopi portatili molto piccoli hanno trovato impiego in luoghi in cui un microscopio da laboratorio sarebbe un peso.
Limitazioni
A ingrandimenti molto elevati con luce trasmessa, gli oggetti puntiformi sono visti come dischi sfocati circondati da anelli di diffrazione . Questi sono chiamati dischi di Airy . Il potere risolutivo di un microscopio è inteso come la capacità di distinguere tra due dischi di Airy ravvicinati (o, in altre parole, la capacità del microscopio di rivelare dettagli strutturali adiacenti come distinti e separati). Sono questi impatti della diffrazione che limitano la capacità di risolvere dettagli fini. L'estensione e l'ampiezza dei modelli di diffrazione sono influenzati sia dalla lunghezza d' onda della luce (λ), dai materiali di rifrazione utilizzati per fabbricare l'obiettivo e dall'apertura numerica (NA) dell'obiettivo. Esiste quindi un limite finito oltre il quale è impossibile risolvere punti separati nel campo obiettivo, noto come limite di diffrazione . Assumendo che le aberrazioni ottiche nell'intero sistema ottico siano trascurabili, la risoluzione d , può essere espressa come:
Solitamente si assume una lunghezza d'onda di 550 nm, che corrisponde alla luce verde . Con l' aria come mezzo esterno, la NA pratica più alta è 0,95 e con l'olio fino a 1,5. In pratica il valore più basso di d ottenibile con gli obiettivi convenzionali è di circa 200 nm. Un nuovo tipo di lente che utilizza la diffusione multipla della luce ha permesso di migliorare la risoluzione al di sotto dei 100 nm.
Superare il limite di risoluzione
Sono disponibili più tecniche per raggiungere risoluzioni superiori al limite di luce trasmessa sopra descritto. Anche le tecniche olografiche, come descritte da Courjon e Bulabois nel 1979, sono in grado di superare questo limite di risoluzione, sebbene la risoluzione fosse limitata nella loro analisi sperimentale.
Utilizzando campioni fluorescenti sono disponibili più tecniche. Gli esempi includono Vertico SMI , la microscopia ottica a scansione di campo vicino che utilizza onde evanescenti e l'esaurimento delle emissioni stimolate . Nel 2005, un microscopio in grado di rilevare una singola molecola è stato descritto come strumento didattico.
Nonostante i significativi progressi dell'ultimo decennio, le tecniche per superare il limite di diffrazione rimangono limitate e specializzate.
Mentre la maggior parte delle tecniche si concentra sull'aumento della risoluzione laterale, esistono anche alcune tecniche che mirano a consentire l'analisi di campioni estremamente sottili. Ad esempio, i metodi Sarfus posizionano il campione sottile su una superficie che migliora il contrasto e quindi consente di visualizzare direttamente film sottili fino a 0,3 nanometri.
L'8 ottobre 2014, il Premio Nobel per la Chimica è stato assegnato a Eric Betzig , William Moerner e Stefan Hell per lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super-risolta .
Illuminazione strutturata SMI
SMI (microscopia a illuminazione modulata spazialmente) è un processo ottico leggero della cosiddetta ingegneria della funzione di diffusione del punto (PSF). Si tratta di processi che modificano la PSF di un microscopio in maniera opportuna sia per aumentare la risoluzione ottica, per massimizzare la precisione delle misure di distanza di oggetti fluorescenti che sono piccoli rispetto alla lunghezza d' onda della luce illuminante, sia per estrarre altri parametri strutturali in la gamma dei nanometri.
Microscopia di localizzazione SPDMphymod
SPDM (microscopia a distanza di precisione spettrale), la tecnologia di microscopia di localizzazione di base è un processo ottico leggero di microscopia a fluorescenza che consente misurazioni di posizione, distanza e angolo su particelle "isolate otticamente" (ad esempio molecole) ben al di sotto del limite teorico di risoluzione per la microscopia ottica. "Isolato otticamente" significa che in un dato momento, viene registrata solo una singola particella/molecola all'interno di una regione di una dimensione determinata dalla risoluzione ottica convenzionale (tipicamente circa 200–250 nm di diametro ). Ciò è possibile quando le molecole all'interno di tale regione portano tutte marcatori spettrali diversi (ad es. colori diversi o altre differenze utilizzabili nell'emissione di luce di particelle diverse).
Molti coloranti fluorescenti standard come GFP , coloranti Alexa, coloranti Atto, Cy2/Cy3 e molecole di fluoresceina possono essere utilizzati per la microscopia di localizzazione, a condizione che siano presenti determinate condizioni fotofisiche. Utilizzando questa tecnologia cosiddetta SPDMphymod (fluorofori modificabili fisicamente) una singola lunghezza d'onda del laser di intensità adeguata è sufficiente per il nanoimaging.
Microscopia 3D a super risoluzione
La microscopia 3D a super risoluzione con coloranti fluorescenti standard può essere ottenuta combinando la microscopia di localizzazione per coloranti fluorescenti standard SPDMphymod e l'illuminazione strutturata SMI.
STED
L'esaurimento delle emissioni stimolate è un semplice esempio di come sia possibile una risoluzione più elevata che supera il limite di diffrazione, ma presenta importanti limitazioni. STED è una tecnica di microscopia a fluorescenza che utilizza una combinazione di impulsi luminosi per indurre la fluorescenza in una piccola sottopopolazione di molecole fluorescenti in un campione. Ogni molecola produce nell'immagine un punto di luce limitato dalla diffrazione e il centro di ciascuno di questi punti corrisponde alla posizione della molecola. Poiché il numero di molecole fluorescenti è basso, è improbabile che i punti di luce si sovrappongano e quindi possono essere posizionati con precisione. Questo processo viene quindi ripetuto molte volte per generare l'immagine. Stefan Hell del Max Planck Institute for Biophysical Chemistry ha ricevuto il 10° German Future Prize nel 2006 e il Premio Nobel per la Chimica nel 2014 per lo sviluppo del microscopio STED e delle metodologie associate.
alternative
Per superare i limiti posti dal limite di diffrazione della luce visibile sono stati progettati altri microscopi che utilizzano altre onde.
- Microscopio a forza atomica (AFM)
- Microscopio elettronico a scansione (SEM)
- Microscopia a scansione di conduttanza ionica (SICM)
- Microscopio a scansione a effetto tunnel (STM)
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Microscopio ultravioletto
- Microscopio a raggi X
È importante notare che le onde a frequenza più elevata hanno un'interazione limitata con la materia, ad esempio i tessuti molli sono relativamente trasparenti ai raggi X risultando in distinte fonti di contrasto e diverse applicazioni target.
L'uso di elettroni e raggi X al posto della luce consente una risoluzione molto più elevata: la lunghezza d'onda della radiazione è più corta, quindi il limite di diffrazione è inferiore. Per rendere non distruttiva la sonda a corta lunghezza d'onda, è stato proposto e ampiamente discusso in letteratura il sistema di imaging a fascio atomico ( atomic nanoscope ), ma non è ancora competitivo con i sistemi di imaging convenzionali.
STM e AFM sono tecniche di scansione della sonda che utilizzano una piccola sonda che viene scansionata sulla superficie del campione. La risoluzione in questi casi è limitata dalle dimensioni della sonda; le tecniche di microlavorazione possono produrre sonde con raggi di punta di 5-10 nm.
Inoltre, metodi come la microscopia elettronica o a raggi X utilizzano un vuoto o un vuoto parziale, che ne limita l'uso per campioni vivi e biologici (ad eccezione di un microscopio elettronico a scansione ambientale ). Le camere dei campioni necessarie per tutti questi strumenti limitano anche la dimensione del campione e la manipolazione del campione è più difficile. Il colore non può essere visto nelle immagini realizzate con questi metodi, quindi alcune informazioni vengono perse. Sono tuttavia essenziali quando si studiano gli effetti molecolari o atomici, come l' invecchiamento in leghe di alluminio o la microstruttura dei polimeri .
Guarda anche
Riferimenti
Fonti citate
- Van Helden, Alberto; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Le origini del telescopio . Stampa dell'Università di Amsterdam. ISBN 978-9069846156.
Ulteriori letture
- "Preparazione di campioni metallografici e materialegrafici, microscopia ottica, analisi delle immagini e prove di durezza", Kay Geels in collaborazione con Struers A/S, ASTM International 2006.
- "Microscopia ottica : una rivoluzione contemporanea in corso" , Siegfried Weisenburger e Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.
link esterno
- Antique Microscopes.com Una collezione di primi microscopi
- Microscopi storici , una collezione illustrata con più di 3000 foto di microscopi scientifici di produttori europei (in tedesco)
- La Collezione Golub , Una collezione di microscopi dal XVII al XIX secolo, incluse ampie descrizioni
- Espressioni molecolari , concetti in microscopia ottica
- Tutorial online di microscopia ottica pratica
- OpenWetWare
- Database centrato sulle celle