Microscopia a contrasto di fase - Phase-contrast microscopy
 Un microscopio a contrasto di fase
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| Usi | Osservazione microscopica di materiale biologico non colorato |
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| Inventore | Frit Zernike |
| Produttore | Leica , Zeiss , Nikon , Olympus e altri |
| Modello | kgt |
| Articoli correlati | Differenziale microscopio a contrasto di interferenza , Hoffman microscopia a modulazione di contrasto , la microscopia a contrasto di fase quantitativa |
La microscopia a contrasto di fase (PCM) è una tecnica di microscopia ottica che converte gli sfasamenti della luce che passa attraverso un campione trasparente in cambiamenti di luminosità nell'immagine. Gli sfasamenti stessi sono invisibili, ma diventano visibili quando vengono mostrati come variazioni di luminosità.
Quando le onde luminose viaggiano attraverso un mezzo diverso dal vuoto , l'interazione con il mezzo fa sì che l' ampiezza e la fase dell'onda cambino in modo dipendente dalle proprietà del mezzo. Le variazioni di ampiezza (luminosità) derivano dalla diffusione e dall'assorbimento della luce, che spesso dipende dalla lunghezza d'onda e può dare origine a colori. L'attrezzatura fotografica e l'occhio umano sono sensibili solo alle variazioni di ampiezza. Senza disposizioni speciali, i cambiamenti di fase sono quindi invisibili. Tuttavia, i cambiamenti di fase spesso trasmettono informazioni importanti.
La microscopia a contrasto di fase è particolarmente importante in biologia. Rivela molte strutture cellulari che sono invisibili con un microscopio a campo chiaro , come esemplificato nella figura. Queste strutture sono state rese visibili ai microscopisti precedenti mediante colorazione , ma ciò ha richiesto un'ulteriore preparazione e morte delle cellule. Il microscopio a contrasto di fase ha permesso ai biologi di studiare le cellule viventi e il modo in cui proliferano attraverso la divisione cellulare . È uno dei pochi metodi disponibili per quantificare la struttura cellulare ei componenti che non utilizzano la fluorescenza . Dopo la sua invenzione nei primi anni '30, la microscopia a contrasto di fase si è rivelata un tale progresso nella microscopia che il suo inventore Frits Zernike è stato insignito del Premio Nobel per la fisica nel 1953.
Principio di funzionamento
Il principio di base per rendere visibili i cambiamenti di fase nella microscopia a contrasto di fase è quello di separare la luce illuminante (sfondo) dalla luce diffusa del campione (che costituisce i dettagli in primo piano) e di manipolarli in modo diverso.
La luce illuminante a forma di anello (verde) che attraversa l' anello del condensatore è focalizzata sul campione dal condensatore. Parte della luce illuminante è diffusa dal campione (giallo). La luce rimanente non è influenzata dal campione e forma la luce di fondo (rossa). Quando si osserva un campione biologico non colorato, la luce diffusa è debole e tipicamente sfasata di -90° (a causa sia dello spessore tipico dei campioni che della differenza dell'indice di rifrazione tra il tessuto biologico e il mezzo circostante) rispetto alla luce di fondo. Ciò fa sì che il primo piano (vettore blu) e lo sfondo (vettore rosso) abbiano quasi la stessa intensità, con conseguente basso contrasto dell'immagine .
In un microscopio a contrasto di fase, il contrasto dell'immagine viene aumentato in due modi: generando un'interferenza costruttiva tra i raggi di luce diffusi e di fondo nelle regioni del campo visivo che contengono il campione e riducendo la quantità di luce di fondo che raggiunge il piano dell'immagine . Innanzitutto, la luce di fondo viene sfasata di −90° facendola passare attraverso un anello di sfasamento, che elimina la differenza di fase tra lo sfondo e i raggi di luce diffusi.
Quando la luce viene quindi focalizzata sul piano dell'immagine (dove è posizionata una fotocamera o un oculare), questo sfasamento fa sì che lo sfondo e i raggi di luce diffusi provenienti dalle regioni del campo visivo che contengono il campione (cioè il primo piano) interferiscano in modo costruttivo , determinando un aumento della luminosità di queste aree rispetto alle regioni che non contengono il campione. Infine, lo sfondo è oscurato ~70-90% da un anello filtro grigio ; questo metodo massimizza la quantità di luce diffusa generata dalla luce di illuminazione (cioè, sfondo), riducendo al minimo la quantità di luce di illuminazione che raggiunge il piano dell'immagine. Parte della luce diffusa che illumina l'intera superficie del filtro sarà sfasata e attenuata dagli anelli, ma in misura molto minore rispetto alla luce di fondo, che illumina solo gli anelli di sfasamento e grigi del filtro.
Quanto sopra descrive il contrasto di fase negativo . Nella sua forma positiva , la luce di fondo è invece sfasata di +90°. La luce di fondo sarà quindi sfasata di 180° rispetto alla luce diffusa. La luce diffusa verrà quindi sottratta dalla luce di sfondo per formare un'immagine con un primo piano più scuro e uno sfondo più chiaro, come mostrato nella prima figura.
Metodi correlati
Il successo del microscopio a contrasto di fase ha portato a una serie di successivi metodi di imaging di fase . Nel 1952, Georges Nomarski brevettò quella che oggi è conosciuta come microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) . Migliora il contrasto creando ombre artificiali, come se l'oggetto fosse illuminato lateralmente. Ma la microscopia DIC non è adatta quando l'oggetto o il suo contenitore alterano la polarizzazione. Con il crescente utilizzo di contenitori di plastica polarizzanti nella biologia cellulare, la microscopia DIC viene sempre più sostituita dalla microscopia a contrasto di modulazione di Hoffman , inventata da Robert Hoffman nel 1975.
I metodi tradizionali a contrasto di fase migliorano otticamente il contrasto, fondendo le informazioni sulla luminosità e sulla fase in un'unica immagine. Dall'introduzione della fotocamera digitale a metà degli anni '90, sono stati sviluppati diversi nuovi metodi di imaging di fase digitale, noti collettivamente come microscopia quantitativa a contrasto di fase . Questi metodi creano digitalmente due immagini separate, una normale immagine in campo chiaro e una cosiddetta immagine a sfasamento . In ogni punto dell'immagine, l'immagine di sfasamento mostra lo sfasamento quantificato indotto dall'oggetto, che è proporzionale allo spessore ottico dell'oggetto.
Guarda anche
Riferimenti
link esterno
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Risorse della biblioteca sulla microscopia a contrasto di fase |
- Primer per microscopia ottica — Microscopia a contrasto di fase della Florida State University
- Microscopi a contrasto di fase e a campo oscuro (Université Paris Sud)