Analisi del valore Phi - Phi value analysis

L'analisi del valore Phi , l' analisi o l'analisi del valore è una tecnica sperimentale di ingegneria proteica per studiare la struttura dello stato di transizione di ripiegamento di piccoli domini proteici che si ripiegano in un modo a due stati. La struttura dello stato di transizione pieghevole è difficile da trovare utilizzando metodi come la proteina NMR o la cristallografia a raggi X perché gli stati di transizione pieghevole sono mobili e parzialmente non strutturati per definizione. Nell'analisi dei valori, la cinetica del ripiegamento e la stabilità del ripiegamento conformazionale della proteina wild-type vengono confrontate con quelle dei mutanti puntiformi per trovare i valori phi . Questi misurano il contributo energetico del residuo mutante allo stato di transizione pieghevole, che rivela il grado di struttura nativa attorno al residuo mutato nello stato di transizione, tenendo conto delle energie libere relative dello stato spiegato, dello stato piegato e dello stato di transizione per proteine ​​wild-type e mutanti. ${\displaystyle \phi}$ ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

I residui della proteina vengono mutati uno per uno per identificare i cluster di residui che sono ben ordinati nello stato di transizione ripiegato. Le interazioni di questi residui possono essere verificate mediante analisi a doppio ciclo mutante${\displaystyle \phi}$ , in cui gli effetti dei mutanti a sito singolo vengono confrontati con quelli dei mutanti doppi. La maggior parte delle mutazioni sono conservative e sostituiscono il residuo originale con uno più piccolo ( mutazioni che creano cavità ) come l' alanina , sebbene possano essere utilizzati anche mutanti tirosina- to- fenilalanina , isoleucina- to- valina e treonina- to- serina . L' inibitore della chimotripsina , i domini SH3 , i singoli domini delle proteine ​​L e G, l' ubiquitina e la barnasi sono stati tutti studiati mediante analisi. ${\displaystyle \phi}$

Approccio matematico

Diagrammi energetici per = 0 (sinistra) o 1 (destra). D è l'energia dello stato denaturato, pugnale, quella dello stato di transizione, e N, quella dello stato nativo.${\displaystyle \phi}$

Phi è così definito:

$${\displaystyle \phi ={\frac {(\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D})}{(\Delta G_{W}^{ N\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{N\rightarrow D})}}={\frac {\Delta \Delta G^{TS\rightarrow D}}{\Delta \Delta G^{N\ freccia a destra D}}}}$$

${\displaystyle \Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}}$è la differenza di energia tra la transizione della proteina wild-type e lo stato denaturato, è la stessa differenza di energia ma per la proteina mutante, ei bit sono le differenze di energia tra lo stato nativo e quello denaturato. Il valore phi è interpretato come quanto la mutazione destabilizza lo stato di transizione rispetto allo stato piegato. ${\displaystyle \Delta G_{M}^{TS\rightarrow D}}$${\displaystyle \Delta G^{N\rightarrow D}}$

Sebbene possa essere stato pensato per variare da zero a uno, possono apparire valori negativi. Un valore pari a zero suggerisce che la mutazione non influisce sulla struttura dello stato di transizione limitante la velocità del percorso di piegatura e un valore di uno suggerisce che la mutazione destabilizza lo stato di transizione tanto quanto lo stato piegato; valori prossimi allo zero suggeriscono che l' area intorno alla mutazione è relativamente dispiegata o non strutturata nello stato di transizione, e valori vicino a uno suggeriscono che la struttura locale dello stato di transizione vicino al sito di mutazione è simile a quella dello stato nativo. Le sostituzioni conservative sulla superficie della proteina spesso danno valori di phi vicini a uno. Quando è compreso tra zero e uno, è meno informativo in quanto non ci dice quale sia il caso: ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

1. Lo stesso stato di transizione è in parte strutturato; o
2. Ci sono due popolazioni proteiche di numero quasi uguale, un tipo che è per lo più spiegato e l'altro che è per lo più ripiegato.

Ipotesi chiave

1. L'analisi del valore Phi assume il postulato di Hammond , il quale afferma che energia e struttura chimica sono correlate. Sebbene la relazione tra il pieghevole intermedio e le strutture dello stato nativo possa correlare quella tra le loro energie quando il panorama energetico ha un minimo globale ben definito e profondo, le destabilizzazioni dell'energia libera potrebbero non fornire informazioni strutturali utili quando il panorama energetico è più piatto o ha molti locali minimi.
2. L'analisi del valore Phi presuppone che il percorso di piegatura non sia significativamente alterato, sebbene possano esserlo le energie di piegatura . Poiché le mutazioni non conservative potrebbero non confermarlo, sono preferite le sostituzioni conservative, sebbene possano dare destabilizzazioni energetiche più piccole che sono più difficili da rilevare.
3. Limitarsi a numeri maggiori di zero equivale a supporre che la mutazione aumenti la stabilità e abbassi l'energia né dello stato nativo né di quello di transizione. È nella stessa linea assunto che le interazioni che stabilizzano uno stato di transizione di ripiegamento siano come quelle della struttura nativa, sebbene alcuni studi sul ripiegamento delle proteine ​​abbiano scoperto che la stabilizzazione delle interazioni non native in uno stato di transizione facilita il ripiegamento.${\displaystyle \phi}$

Esempio: barnase

Alan Fersht ha aperto la strada all'analisi del valore phi nel suo studio sulla piccola proteina batterica barnasi . Usando simulazioni di dinamica molecolare , ha scoperto che lo stato di transizione tra piegatura e spiegamento assomiglia allo stato nativo ed è lo stesso indipendentemente dalla direzione della reazione. Phi variava con la posizione della mutazione poiché alcune regioni davano valori vicini allo zero e altre vicino a uno. La distribuzione dei valori in tutta la sequenza della proteina concordava con tutto lo stato di transizione simulato tranne un'elica che si piegava in modo semi-indipendente e creava contatti simili a quelli nativi con il resto della proteina solo una volta che lo stato di transizione si era formato completamente. Tale variazione nella velocità di ripiegamento in una proteina rende difficile interpretare i valori poiché la struttura dello stato di transizione deve essere altrimenti confrontata con simulazioni di ripiegamento-dispiegamento che sono computazionalmente costose. ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

varianti

Altre tecniche di "perturbazione cinetica" per studiare lo stato di transizione del ripiegamento sono apparse di recente. Il più noto è il valore psi ( ) che si trova ingegnerizzando due residui di amminoacidi che legano il metallo come l' istidina in una proteina e quindi registrando la cinetica di piegatura in funzione della concentrazione di ioni metallici, sebbene Fersht ritenesse difficile questo approccio. Una variante " reticolata " del valore - è stata utilizzata per studiare l'associazione di segmenti in uno stato di transizione di ripiegamento quando sono stati introdotti legami incrociati covalenti come i legami disolfuro . ${\displaystyle \psi}$${\displaystyle \phi}$

Limitazioni

L'errore nelle misurazioni della stabilità dell'equilibrio e della velocità di (un)folding acquoso può essere grande quando i valori di per soluzioni con denaturanti devono essere estrapolati a soluzioni acquose che sono quasi pure o la differenza di stabilità tra la proteina nativa e mutante è "bassa" o inferiore superiore a 7 kJ/mol. Ciò può causare il superamento dell'intervallo zero-uno. I valori calcolati dipendono fortemente dal numero di punti dati disponibili e dalle condizioni di laboratorio. ${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$${\displaystyle \phi}$

Guarda anche

• Trama Chevron
• Punto medio di denaturazione
• Equilibrio che si dispiega

Riferimenti