Trascrittasi inversa - Reverse transcriptase

Trascrittasi inversa
(DNA polimerasi RNA-dipendente)
Trascrittasi inversa 3KLF label.png
Struttura cristallografica della trascrittasi inversa dell'HIV-1 dove sono colorate le due subunità p51 e p66 e sono evidenziati i siti attivi della polimerasi e della nucleasi.
Identificatori
Simbolo RVT_1
Pfam PF00078
Clan Pfam CL0027
InterPro IPR000477
PROSITO PS50878
SCOP2 1hmv / SCOPe / SUPFAM
CDD cd00304
DNA polimerasi RNA-diretto
Identificatori
CE n. 2.7.7.49
CAS n. 9068-38-6
Banche dati
IntEnz Vista IntEnz
BRENDA Ingresso BRENDA
ExPASy NiceZyme view
KEGG Ingresso KEGG
MetaCyc passaggio metabolico
PRIAM profilo
Strutture PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Ontologia genica AmiGO / QuickGO

Una trascrittasi inversa (RT) è un enzima utilizzato per generare DNA complementare (cDNA) da uno stampo di RNA , un processo chiamato trascrizione inversa . Le trascrittasi inverse sono utilizzate da virus come l' HIV e l' epatite B per replicare i loro genomi, da elementi genetici mobili retrotrasposoni per proliferare all'interno del genoma ospite e dalle cellule eucariotiche per estendere i telomeri alle estremità dei loro cromosomi lineari . Contrariamente a una credenza ampiamente diffusa, il processo non viola i flussi di informazioni genetiche descritti dal dogma centrale classico , poiché i trasferimenti di informazioni dall'RNA al DNA sono esplicitamente ritenuti possibili.

La RT retrovirale ha tre attività biochimiche sequenziali: attività della DNA polimerasi RNA-dipendente , ribonucleasi H (RNasi H) e attività della DNA polimerasi DNA-dipendente. Collettivamente, queste attività consentono all'enzima di convertire l'RNA a singolo filamento in cDNA a doppio filamento. Nei retrovirus e nei retrotrasposoni, questo cDNA può quindi integrarsi nel genoma dell'ospite, dal quale possono essere fatte nuove copie di RNA tramite la trascrizione della cellula ospite . La stessa sequenza di reazioni è ampiamente utilizzata in laboratorio per convertire l'RNA in DNA per l'uso nella clonazione molecolare , nel sequenziamento dell'RNA , nella reazione a catena della polimerasi (PCR) o nell'analisi del genoma .

Storia

Le trascrittasi inverse sono state scoperte da Howard Temin presso l' Università del Wisconsin-Madison nei virioni del sarcoma di Rous e isolate indipendentemente da David Baltimore nel 1970 al MIT da due virus tumorali a RNA: il virus della leucemia murina e di nuovo il virus del sarcoma di Rous . Per i loro successi, hanno condiviso il Premio Nobel 1975 in Fisiologia o Medicina (con Renato Dulbecco ).

Le trascrittasi inverse ben studiate includono:

Funzione nei virus

La trascrittasi inversa è mostrata con le regioni del dito, del palmo e del pollice. Gli amminoacidi catalitici del sito attivo della RNasi H e del sito attivo della polimerasi sono mostrati in forma sferica.

Gli enzimi sono codificati e utilizzati da virus che utilizzano la trascrizione inversa come fase del processo di replicazione. I virus a RNA a trascrizione inversa , come i retrovirus , utilizzano l'enzima per trascrivere inversamente i loro genomi a RNA in DNA, che viene quindi integrato nel genoma ospite e replicato insieme ad esso. I virus del DNA a trascrizione inversa , come gli epadnavirus , possono consentire all'RNA di fungere da modello nell'assemblaggio e nella creazione di filamenti di DNA. L'HIV infetta l'uomo con l'uso di questo enzima. Senza la trascrittasi inversa, il genoma virale non sarebbe in grado di incorporarsi nella cellula ospite, con conseguente mancata replicazione.

Processo di trascrizione inversa o retrotrascrizione

La trascrittasi inversa crea DNA a doppio filamento da uno stampo di RNA.

Nelle specie virali con trascrittasi inversa prive di attività DNA polimerasi DNA-dipendente, la creazione di DNA a doppio filamento può essere effettuata dalla DNA polimerasi δ codificata dall'ospite , scambiando il DNA-RNA virale per un primer e sintetizzando un DNA a doppio filamento da un meccanismo simile alla rimozione del primer , in cui il DNA appena sintetizzato sposta lo stampo di RNA originale.

Il processo di trascrizione inversa, chiamato anche retrotrascrizione o retrotras, è estremamente soggetto a errori ed è durante questo passaggio che possono verificarsi mutazioni. Tali mutazioni possono causare resistenza ai farmaci .

Trascrizione inversa retrovirale

Meccanismo di trascrizione inversa nell'HIV. I numeri dei passaggi non corrispondono.

I retrovirus , detti anche virus ssRNA-RT di classe VI , sono virus a trascrizione inversa dell'RNA con un DNA intermedio. I loro genomi sono costituiti da due molecole di RNA a singolo filamento a senso positivo con un cappuccio 5' e una coda poliadenilata 3' . Esempi di retrovirus includono il virus dell'immunodeficienza umana ( HIV ) e il virus T-linfotropico umano ( HTLV ). La creazione di DNA a doppio filamento avviene nel citosol come una serie di questi passaggi:

  1. Lysyl tRNA agisce come un primer e si ibrida con una parte complementare del genoma dell'RNA del virus chiamata sito di legame del primer o PBS.
  2. La trascrittasi inversa aggiunge quindi nucleotidi di DNA all'estremità 3' del primer, sintetizzando il DNA complementare alla regione U5 (regione non codificante) e alla regione R (una ripetizione diretta trovata su entrambe le estremità della molecola di RNA) dell'RNA virale.
  3. Un dominio sull'enzima trascrittasi inversa chiamato RNAsi H degrada le regioni U5 e R all'estremità 5' dell'RNA.
  4. Il primer tRNA quindi "salta" all'estremità 3' del genoma virale e i filamenti di DNA appena sintetizzati si ibridano alla regione R complementare sull'RNA.
  5. Il DNA complementare (cDNA) aggiunto in (2) è ulteriormente esteso.
  6. La maggior parte dell'RNA virale viene degradata dall'RNAsi H, lasciando solo la sequenza PP.
  7. Inizia la sintesi del secondo filamento di DNA, utilizzando il frammento PP rimanente dell'RNA virale come primer.
  8. Il primer del tRNA se ne va e si verifica un "salto". Il PBS del secondo filamento si ibrida con il PBS complementare del primo filamento.
  9. Entrambi i filamenti vengono estesi per formare una copia completa del DNA a doppio filamento del genoma dell'RNA virale originale, che può quindi essere incorporato nel genoma dell'ospite dall'enzima integrasi .

La creazione del DNA a doppio filamento comporta anche il trasferimento del filamento , in cui vi è una traslocazione del prodotto di DNA corto dalla sintesi iniziale del DNA dipendente dall'RNA alle regioni modello accettore all'altra estremità del genoma, che vengono successivamente raggiunte ed elaborate dalla trascrittasi inversa per la sua attività DNA dipendente dal DNA.

L'RNA retrovirale è disposto in 5' capolinea a 3' capolinea. Il sito in cui il primer viene ricotto all'RNA virale è chiamato sito di legame del primer (PBS). L'estremità dell'RNA 5' al sito PBS è chiamata U5 e l'estremità 3' dell'RNA al sito PBS è chiamata leader. Il primer tRNA è svolto tra 14 e 22 nucleotidi e forma un duplex accoppiato con le basi con l'RNA virale a PBS. Il fatto che il PBS si trovi vicino al terminale 5' dell'RNA virale è insolito perché la trascrittasi inversa sintetizza il DNA dall'estremità 3' del primer nella direzione 5'-3' (rispetto al filamento di DNA appena sintetizzato). Pertanto, il primer e la trascrittasi inversa devono essere riposizionati all'estremità 3' dell'RNA virale. Per realizzare questo riposizionamento, sono necessari più passaggi e vari enzimi tra cui la DNA polimerasi , la ribonucleasi H (RNasi H) e lo svolgimento del polinucleotide.

La trascrittasi inversa dell'HIV ha anche attività ribonucleasica che degrada l'RNA virale durante la sintesi del cDNA, nonché attività DNA polimerasi DNA-dipendente che copia il filamento cDNA senso in un DNA antisenso per formare un DNA virale intermedio a doppio filamento (vDNA) .

Nella vita cellulare

Tratti autoreplicanti di genomi eucariotici noti come retrotrasposoni utilizzano la trascrittasi inversa per spostarsi da una posizione all'altra nel genoma tramite un intermedio di RNA. Si trovano in abbondanza nei genomi di piante e animali. La telomerasi è un'altra trascrittasi inversa che si trova in molti eucarioti, inclusi gli esseri umani, che trasporta il proprio modello di RNA ; questo RNA è usato come stampo per la replicazione del DNA .

Le prime segnalazioni di trascrittasi inversa nei procarioti risalgono al 1971 in Francia ( Beljanski et al., 1971a, 1972) e pochi anni dopo in URSS (Romashchenko 1977). Da allora questi sono stati ampiamente descritti come parte dei retroni batterici , sequenze distinte che codificano per la trascrittasi inversa e sono utilizzati nella sintesi di msDNA . Per avviare la sintesi del DNA, è necessario un primer. Nei batteri, il primer viene sintetizzato durante la replicazione.

Valerian Dolja dell'Oregon State sostiene che i virus, a causa della loro diversità, hanno svolto un ruolo evolutivo nello sviluppo della vita cellulare, con la trascrittasi inversa che svolge un ruolo centrale.

Struttura

La trascrittasi inversa impiega una struttura "della mano destra" simile a quella trovata in altre polimerasi dell'acido nucleico virale . Oltre alla funzione di trascrizione, le trascrittasi inverse retrovirali hanno un dominio appartenente alla famiglia delle RNasi H , vitale per la loro replicazione. Degradando il modello di RNA, consente di sintetizzare l'altro filamento di DNA. Alcuni frammenti della digestione servono anche come primer per la DNA polimerasi (lo stesso enzima o una proteina ospite), responsabile della produzione dell'altro filamento (più).

Fedeltà di replica

Esistono tre diversi sistemi di replicazione durante il ciclo di vita di un retrovirus. Il primo processo è la sintesi della trascrittasi inversa del DNA virale dall'RNA virale, che forma quindi filamenti di DNA complementari appena creati. Il secondo processo di replicazione si verifica quando la DNA polimerasi cellulare dell'ospite replica il DNA virale integrato. Infine, l'RNA polimerasi II trascrive il DNA provirale in RNA, che sarà impacchettato nei virioni. La mutazione può verificarsi durante uno o tutti questi passaggi di replica.

La trascrittasi inversa ha un alto tasso di errore durante la trascrizione dell'RNA nel DNA poiché, a differenza della maggior parte delle altre DNA polimerasi , non ha capacità di correzione di bozze . Questo alto tasso di errore consente alle mutazioni di accumularsi a un ritmo accelerato rispetto alle forme di replica corrette. Le trascrittasi inverse disponibili in commercio prodotte da Promega sono citate dai loro manuali come aventi tassi di errore nell'intervallo di 1 su 17.000 basi per AMV e 1 su 30.000 basi per M-MLV.

Oltre a creare polimorfismi a singolo nucleotide , è stato anche dimostrato che le trascrittasi inverse sono coinvolte in processi come fusioni di trascrizioni , mescolamento di esoni e creazione di trascrizioni antisenso artificiali . È stato ipotizzato che questa attività di commutazione del modello della trascrittasi inversa, che può essere dimostrata completamente in vivo , potrebbe essere stata una delle cause per trovare diverse migliaia di trascritti non annotati nei genomi di organismi modello.

Cambio modello

Due genomi di RNA sono impacchettati in ogni particella di retrovirus, ma, dopo un'infezione, ogni virus genera solo un provirus . Dopo l'infezione, la trascrizione inversa è accompagnata dalla commutazione del modello tra le due copie del genoma (ricombinazione della scelta della copia). Ci sono due modelli che suggeriscono perché la trascrittasi dell'RNA cambia i modelli. Il primo, il modello di scelta forzata della copia, propone che la trascrittasi inversa cambi lo stampo dell'RNA quando incontra un nick, il che implica che la ricombinazione è obbligatoria per mantenere l'integrità del genoma del virus. Il secondo, il modello di scelta dinamica, suggerisce che la trascrittasi inversa cambia i modelli quando la funzione dell'RNAsi e la funzione della polimerasi non sono sincronizzate in termini di velocità, il che implica che la ricombinazione avviene in modo casuale e non è in risposta al danno genomico. Uno studio di Rawson et al. supportato entrambi i modelli di ricombinazione. Da 5 a 14 eventi di ricombinazione per genoma si verificano ad ogni ciclo di replicazione. La commutazione del modello (ricombinazione) sembra essere necessaria per mantenere l'integrità del genoma e come meccanismo di riparazione per salvare i genomi danneggiati.

Applicazioni

La struttura molecolare della zidovudina (AZT), un farmaco usato per inibire la trascrittasi inversa

Farmaci antivirali

Poiché l' HIV utilizza la trascrittasi inversa per copiare il suo materiale genetico e generare nuovi virus (parte di un circolo di proliferazione dei retrovirus), sono stati progettati farmaci specifici per interrompere il processo e quindi sopprimerne la crescita. Collettivamente, questi farmaci sono noti come inibitori della trascrittasi inversa e comprendono gli analoghi nucleosidici e nucleotidici zidovudina (nome commerciale Retrovir), lamivudina (Epivir) e tenofovir (Viread), nonché inibitori non nucleosidici, come la nevirapina (Viramune).

Biologia molecolare

Trascrittasi inversa è comunemente usato nella ricerca per applicare la reazione a catena della polimerasi tecnica per RNA in una tecnica chiamata trascrizione polymerase chain reaction inversa (RT-PCR). La tecnica PCR classica può essere applicata solo ai filamenti di DNA , ma, con l'aiuto della trascrittasi inversa, l'RNA può essere trascritto nel DNA, rendendo così possibile l' analisi PCR delle molecole di RNA. Trascrittasi inversa viene utilizzata anche per creare librerie di cDNA da mRNA . La disponibilità commerciale della trascrittasi inversa ha notevolmente migliorato le conoscenze nel campo della biologia molecolare, poiché, insieme ad altri enzimi , ha permesso agli scienziati di clonare, sequenziare e caratterizzare l'RNA.

La trascrittasi inversa è stata impiegata anche nella produzione di insulina . Inserendo l'mRNA eucariotico per la produzione di insulina insieme alla trascrittasi inversa nei batteri, l'mRNA potrebbe essere inserito nel genoma del procariota. Possono quindi essere create grandi quantità di insulina, eludendo la necessità di raccogliere pancreas di maiale e altre fonti tradizionali. L'inserimento diretto del DNA eucariotico nei batteri non funzionerebbe perché trasporta introni , quindi non si tradurrebbe con successo utilizzando i ribosomi batterici. L'elaborazione nella cellula eucariotica durante la produzione di mRNA rimuove questi introni per fornire uno stampo adatto. La trascrittasi inversa converte questo RNA modificato in DNA in modo che possa essere incorporato nel genoma.

Guarda anche

Riferimenti

link esterno