Microscopia a super risoluzione - Super-resolution microscopy

La microscopia a super-risoluzione è una serie di tecniche in microscopia ottica che consentono a tali immagini di avere risoluzioni superiori a quelle imposte dal limite di diffrazione , che è dovuto alla diffrazione della luce . Le tecniche di imaging a super risoluzione si basano sul campo vicino (microscopia a tunnel di fotoni e su quelle che utilizzano il Pendry Superlens e la microscopia ottica a scansione in campo vicino ) o sul campo lontano . Tra le tecniche che si affidano a quest'ultimo ci sono quelle che migliorano la risoluzione solo modestamente (fino a circa un fattore due) oltre il limite di diffrazione, come la microscopia confocale con foro stenopeico chiuso o aiutata da metodi computazionali come la deconvoluzione o il pixel basato su rivelatore riassegnazione (es. microscopia re-scan, riassegnazione pixel), il microscopio 4Pi e le tecnologie di microscopia a illuminazione strutturata come SIM e SMI .

Esistono due principali gruppi di metodi per la microscopia a super risoluzione nel campo lontano che possono migliorare la risoluzione di un fattore molto più ampio:

1. Super-risoluzione deterministica: gli emettitori più comunemente usati in microscopia biologica, i fluorofori , mostrano una risposta non lineare all'eccitazione, che può essere sfruttata per migliorare la risoluzione. Tali metodi includono STED , GSD , RESOLFT e SSIM.
2. Super-risoluzione stocastica: la complessità chimica di molte sorgenti di luce molecolare conferisce loro un comportamento temporale complesso, che può essere utilizzato per far sì che diversi fluorofori vicini emettano luce in momenti separati e quindi diventino risolvibili nel tempo. Questi metodi includono l' imaging a fluttuazione ottica a super risoluzione (SOFI) e tutti i metodi di localizzazione di singole molecole (SMLM), come SPDM , SPDMphymod , PALM , FPALM, STORM e dSTORM.

L'8 ottobre 2014 il Premio Nobel per la Chimica è stato assegnato a Eric Betzig , WE Moerner e Stefan Hell per "lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super-risolta ", che porta la " microscopia ottica nella nanodimensione ". Le diverse modalità di microscopia a super risoluzione sono sempre più adottate dalla comunità della ricerca biomedica e queste tecniche stanno diventando strumenti indispensabili per comprendere la funzione biologica a livello molecolare.

Storia

Nel 1978, erano state sviluppate le prime idee teoriche per rompere il limite di Abbe , che richiedeva l'utilizzo di un microscopio 4Pi come microscopio confocale a fluorescenza a scansione laser in cui la luce viene focalizzata da tutti i lati su un fuoco comune utilizzato per scansionare l'oggetto dall'eccitazione "punto per punto" combinata con il rilevamento "punto per punto". Tuttavia, la pubblicazione del 1978 aveva tratto una conclusione fisica impropria (cioè un punto di luce puntiforme) e aveva completamente mancato l'aumento della risoluzione assiale come vantaggio effettivo dell'aggiunta dell'altro lato dell'angolo solido.

Alcune delle seguenti informazioni sono state raccolte (con il permesso) dalla recensione di un blog di chimica sulle tecniche di microscopia a sub-diffrazione.

Nel 1986 Okhonin brevettò un microscopio ottico a super risoluzione basato sull'emissione stimolata.

Tecniche di super risoluzione

Microscopia a tunnel di fotoni (PTM)

Miglioramento locale / ANSOM / nano-antenne ottiche

Microscopia a mappatura casuale ottica in campo vicino (NORM)

La microscopia a mappatura casuale ottica in campo vicino (NORM) è un metodo di acquisizione ottica in campo vicino da un microscopio a campo lontano attraverso l'osservazione del moto browniano delle nanoparticelle in un liquido di immersione.

NORM utilizza la scansione della superficie dell'oggetto mediante nanoparticelle che si muovono stocasticamente. Al microscopio, le nanoparticelle sembrano punti rotondi simmetrici. La larghezza dello spot è equivalente alla funzione di diffusione del punto (~ 250 nm) ed è definita dalla risoluzione del microscopio. Le coordinate laterali della data particella possono essere valutate con una precisione molto superiore alla risoluzione del microscopio. Raccogliendo le informazioni da molti fotogrammi è possibile mappare la distribuzione dell'intensità del campo vicino attraverso l'intero campo visivo del microscopio. Rispetto a NSOM e ANSOM questo metodo non richiede alcuna attrezzatura speciale per il posizionamento della punta e ha un ampio campo visivo e una profondità di fuoco. A causa dell'elevato numero di "sensori" di scansione, è possibile ottenere l'acquisizione dell'immagine in un tempo più breve.

4Pi

Un microscopio 4Pi è un microscopio a fluorescenza a scansione laser con una risoluzione assiale migliorata . Il valore tipico di 500-700 nm può essere migliorato a 100-150 nm, che corrisponde a un punto focale quasi sferico con un volume 5-7 volte inferiore a quello della microscopia confocale standard .

Il miglioramento della risoluzione si ottiene utilizzando due obiettivi opposti, entrambi focalizzati nella stessa posizione geometrica. Inoltre, la differenza nella lunghezza del percorso ottico attraverso ciascuna delle due lenti dell'obiettivo viene accuratamente ridotta al minimo. In questo modo, le molecole che risiedono nell'area focale comune di entrambi gli obiettivi possono essere illuminate coerentemente da entrambi i lati e la luce riflessa o emessa può essere raccolta coerentemente, cioè è possibile una sovrapposizione coerente della luce emessa sul rivelatore. L' angolo solido utilizzato per l'illuminazione e il rilevamento viene aumentato e si avvicina al caso ideale, in cui il campione viene illuminato e rilevato da tutti i lati contemporaneamente. ${\displaystyle\Omega}$

Finora, la migliore qualità in un microscopio 4Pi è stata raggiunta in combinazione con la microscopia STED in cellule fisse e la microscopia RESOLFT con proteine ​​commutabili nelle cellule viventi.

Microscopia a illuminazione strutturata (SIM)

Confronto della risoluzione ottenuta mediante microscopia confocale a scansione laser (in alto) e microscopia a illuminazione strutturata 3D (Microscopia 3D-SIM, in basso). Sono mostrati i dettagli di un involucro nucleare . Pori nucleari (anti-NPC) rosso, involucro nucleare (anti- Lamin ) verde, cromatina ( colorazione DAPI ) blu. Barra della scala: 1µm.

La microscopia a illuminazione strutturata (SIM) migliora la risoluzione spaziale raccogliendo informazioni dallo spazio delle frequenze al di fuori della regione osservabile. Questo processo avviene nello spazio reciproco: la trasformata di Fourier (FT) di un'immagine SI contiene informazioni aggiuntive sovrapposte da diverse aree dello spazio reciproco; con diversi frame in cui l'illuminazione è spostata di una fase , è possibile separare e ricostruire computazionalmente l'immagine FT, che ha molte più informazioni sulla risoluzione. Il FT inverso restituisce l'immagine ricostruita a un'immagine a super risoluzione.

La microscopia SIM potrebbe potenzialmente sostituire la microscopia elettronica come strumento per alcune diagnosi mediche. Questi includono la diagnosi di disturbi renali, cancro ai reni e malattie del sangue.

Sebbene il termine "microscopia a illuminazione strutturata" sia stato coniato da altri negli anni successivi, Guerra (1995) ha pubblicato per la prima volta risultati in cui la luce modellata da un reticolo di passo 50 nm illuminava un secondo reticolo di passo 50 nm, con i reticoli ruotati rispetto a ciascuno altro dalla quantità angolare necessaria per ottenere l'ingrandimento. Sebbene la lunghezza d'onda illuminante fosse di 650 nm, il reticolo di 50 nm è stato facilmente risolto. Ciò ha mostrato un miglioramento di quasi 5 volte rispetto al limite di risoluzione di Abbe di 232 nm che avrebbe dovuto essere il più piccolo ottenuto per l'apertura numerica e la lunghezza d'onda utilizzata. In un ulteriore sviluppo di questo lavoro, Guerra ha mostrato che la topografia laterale super-risolta si ottiene spostando di fase il campo evanescente. Diversi brevetti statunitensi sono stati rilasciati a Guerra individualmente, o con colleghi, e assegnati alla Polaroid Corporation . Le licenze per questa tecnologia sono state acquistate da Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. e Nanoptek Corp. per l'uso di questa tecnica a super risoluzione nell'archiviazione di dati ottici e nella microscopia.

• Immagini di nuclei cellulari e stadi mitotici registrati con 3D-SIM.
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  Microscopia confocale di confronto – 3D-SIM

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  Nucleo cellulare in profase da varie angolazioni

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  Due nuclei di cellule di topo in profase.

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  cellula di topo in telofase

Illuminazione a modulazione spaziale (SMI)

SMI + TIRF del tessuto oculare umano affetto da degenerazione maculare

Un'implementazione dell'illuminazione strutturata è nota come illuminazione modulata spazialmente (SMI). Come l'illuminazione strutturata standard, la tecnica SMI modifica la funzione di diffusione del punto (PSF) di un microscopio in modo appropriato. In questo caso però "la risoluzione ottica in sé non viene potenziata"; invece l'illuminazione strutturata viene utilizzata per massimizzare la precisione delle misurazioni della distanza di oggetti fluorescenti, per "consentire misurazioni dimensionali a dimensioni molecolari di poche decine di nanometri".

Il microscopio Vertico SMI ottiene un'illuminazione strutturata utilizzando uno o due raggi laser interferenti opposti lungo l'asse. L'oggetto che viene ripreso viene quindi spostato in passaggi ad alta precisione attraverso il campo d'onda, oppure il campo d'onda stesso viene spostato rispetto all'oggetto da sfasamenti. Ciò si traduce in una migliore dimensione assiale e risoluzione della distanza.

SMI può essere combinato con altre tecnologie a super risoluzione, ad esempio con 3D LIMON o LSI- TIRF come interferometro a riflessione interna totale con illuminazione strutturata lateralmente (questo ultimo strumento e tecnica è essenzialmente un microscopio a effetto tunnel fotonico a sfasamento, che impiega un microscopio ottico a riflessione con campo evanescente sfasato (Guerra, 1996)). Questa tecnica SMI consente di acquisire immagini ottico-luce delle distribuzioni di autofluorofori in sezioni di tessuto oculare umano con una risoluzione ottica precedentemente ineguagliata. L'uso di tre diverse lunghezze d'onda di eccitazione (488, 568 e 647 nm), consente di raccogliere informazioni spettrali sul segnale di autofluorescenza. Questo è stato utilizzato per esaminare il tessuto oculare umano affetto da degenerazione maculare .

Tecniche funzionali deterministiche

La microscopia a transizioni di fluorescenza ottica saturabile reversibile (RESOLFT) è una microscopia ottica ad altissima risoluzione in grado di visualizzare dettagli in campioni che non possono essere visualizzati con la microscopia convenzionale o confocale . All'interno di RESOLFT vengono generalizzati i principi della microscopia STED e della microscopia GSD . Inoltre, esistono tecniche con concetti diversi da RESOLFT o SSIM. Ad esempio, la microscopia a fluorescenza che utilizza la proprietà del gate ottico AND del centro di vacanza dell'azoto o la super-risoluzione mediante l'emissione stimolata di radiazione termica (SETR), che utilizza le superlinearità intrinseche della radiazione del corpo nero ed espande il concetto di super -risoluzione oltre la microscopia.

Riduzione delle emissioni stimolate (STED)

Miglioramento della risoluzione tra microscopia confocale tradizionale e microscopia STED.

La microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED) utilizza due impulsi laser, l'impulso di eccitazione per l'eccitazione dei fluorofori al loro stato fluorescente e l'impulso STED per la diseccitazione dei fluorofori mediante emissione stimolata . In pratica, viene prima applicato l'impulso laser di eccitazione dopodiché segue presto un impulso STED (viene utilizzato anche STED senza impulsi utilizzando laser ad onda continua). Inoltre, l'impulso STED viene modificato in modo tale da presentare un punto di intensità zero che coincide con il punto focale di eccitazione. A causa della dipendenza non lineare della velocità di emissione stimolata dall'intensità del fascio STED, tutti i fluorofori attorno al punto focale di eccitazione saranno nel loro stato spento (lo stato fondamentale dei fluorofori). Scansionando questo punto focale, si recupera l'immagine. L' intera larghezza a metà massimo (FWHM) della funzione di diffusione del punto (PSF) del punto focale di eccitazione può teoricamente essere compressa a una larghezza arbitraria aumentando l'intensità dell'impulso STED, secondo l'equazione ( 1 ).

${\ Displaystyle \ Delta r \ circa {\ frac {\ Delta }{\ sqrt {1+I_{\max }/I_{s}}}}}$   ( 1 )

dove Δr è la risoluzione laterale, Δ è la FWHM della diffrazione limitata PSF, I _max è la massima intensità del laser STED, ed è l'intensità soglia necessaria per conseguire deplezione emissione saturo.${\displaystyle I_{s}}$

Il principale svantaggio di STED, che ne ha impedito l'uso diffuso, è che il macchinario è complicato. Da un lato, la velocità di acquisizione dell'immagine è relativamente lenta per ampi campi visivi a causa della necessità di scansionare il campione per recuperare un'immagine. D'altra parte, può essere molto veloce per campi visivi più piccoli: sono state mostrate registrazioni fino a 80 fotogrammi al secondo. A causa di un grande valore di I _s associato a STED, è necessario un impulso di eccitazione ad alta intensità, che può causare danni al campione.

Esaurimento dello stato fondamentale (GSD)

La microscopia a deplezione dello stato fondamentale ( microscopia GSD) utilizza lo stato tripletto di un fluoroforo come stato off e lo stato singoletto come stato on, per cui un laser di eccitazione viene utilizzato per guidare i fluorofori alla periferia della molecola dello stato singoletto verso il stato di tripletta. Questo è molto simile a STED, dove lo stato off è lo stato fondamentale dei fluorofori, motivo per cui l'equazione ( 1 ) si applica anche in questo caso. Il valore è inferiore rispetto a STED, rendendo possibile l'imaging a super risoluzione con un'intensità laser molto più piccola. Rispetto allo STED, però, i fluorofori utilizzati nel GSD sono generalmente meno fotostabili; e la saturazione dello stato di tripletta può essere più difficile da realizzare. ${\displaystyle I_{s}}$

Microscopia a illuminazione strutturata saturata (SSIM)

La microscopia a illuminazione strutturata saturata (SSIM) sfrutta la dipendenza non lineare della velocità di emissione dei fluorofori dall'intensità del laser di eccitazione. Applicando un pattern di illuminazione sinusoidale con un'intensità di picco prossima a quella necessaria per saturare i fluorofori nel loro stato fluorescente, si recuperano le frange Moiré. Le frange contengono informazioni spaziali di ordine elevato che possono essere estratte mediante tecniche computazionali. Una volta estratte le informazioni, viene recuperata un'immagine a super risoluzione.

SSIM richiede lo spostamento del modello di illuminazione più volte, limitando efficacemente la risoluzione temporale della tecnica. Inoltre vi è la necessità di fluorofori molto fotostabili, a causa delle condizioni di saturazione, che infliggono danni da radiazioni al campione e limitano le possibili applicazioni per le quali SSIM può essere utilizzato.

Esempi di questa microscopia sono mostrati nella sezione Microscopia ad illuminazione strutturata (SIM) : immagini di nuclei cellulari e stadi mitotici registrati con microscopia 3D-SIM.

Tecniche funzionali stocastiche

Microscopia di localizzazione

La microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) riassume tutte le tecniche microscopiche che raggiungono la super-risoluzione isolando gli emettitori e adattando le loro immagini alla funzione di diffusione del punto (PSF). Normalmente, la larghezza della funzione di diffusione del punto (~ 250 nm) limita la risoluzione. Tuttavia, dato un emettitore isolato, è possibile determinarne la posizione con una precisione limitata solo dalla sua intensità secondo l'equazione ( 2 ).

${\ Displaystyle \ Delta \ mathrm {loc} \ circa {\ frac {\ Delta }{\ sqrt {N}}}}$   ( 2 )

dove Δloc è la precisione di localizzazione, è il FWHM (larghezza completa a metà massimo) della PSF e N è il numero di fotoni raccolti.

Questo processo di adattamento può essere eseguito in modo affidabile solo per emettitori isolati (vedi Deconvoluzione ), e campioni biologici interessanti sono così densamente etichettati con emettitori che l'adattamento è impossibile quando tutti gli emettitori sono attivi contemporaneamente. Le tecniche SMLM risolvono questo dilemma attivando solo un sottoinsieme sparso di emettitori allo stesso tempo, localizzando questi pochi emettitori in modo molto preciso, disattivandoli e attivando un altro sottoinsieme.

Considerando la pixelizzazione dello sfondo e della fotocamera e utilizzando l'approssimazione gaussiana per la funzione di diffusione del punto ( disco di Airy ) di un tipico microscopio, la risoluzione teorica è proposta da Thompson et al. e messo a punto da Mortensen et al.:

${\displaystyle \sigma ^{2}={\frac {\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12}{N_{sig}}}({\frac {16}{9} }+{\frac {8\pi N_{bg}(\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12)}{N_{sig}a^{2}}})}$

dove

* σ è la deviazione standard gaussiana delle posizioni centrali della stessa molecola se misurata più volte (es. fotogrammi di un video). (unità m)

* σ _PSF è la deviazione standard gaussiana della funzione di diffusione puntuale, il cui FWHM segue l' equazione di Ernst Abbe d = λ/(2 NA) . (unità m)

* a è la dimensione di ogni pixel dell'immagine. (unità m)

* N _sig è il numero di fotoni della PSF totale su tutti i pixel di interesse. (senza unità)

* N _bg il numero medio di fotoni di sfondo per pixel (conteggi scuri già rimossi), che è approssimato come il quadrato della deviazione standard gaussiana del rumore di fondo della distribuzione di Poisson di ciascun pixel nel tempo o la deviazione standard di tutti i pixel con solo rumore di fondo , σ _bg ² . Maggiore è la σ _bg ² , migliore è l'approssimazione (es buono per σ _bg ² > 10, eccellente per σ _bg ² > 1000). (senza unità)

* La risoluzione FWHM è ~2.355 volte la deviazione standard gaussiana .

Generalmente, la microscopia di localizzazione viene eseguita con fluorofori. I fluorofori adatti (ad es. per STORM) risiedono in uno stato oscuro non fluorescente per la maggior parte del tempo e vengono attivati ​​stocasticamente, tipicamente con un laser di eccitazione di bassa intensità. Un laser di lettura stimola la fluorescenza e sbianca o commuta i fluorofori in uno stato scuro, in genere entro 10-100 ms. Nell'accumulo di punti per l'imaging nella topografia su scala nanometrica (PAINT), i fluorofori sono non fluorescenti prima del legame e fluorescenti dopo. I fotoni emessi durante la fase fluorescente vengono raccolti con una fotocamera e l'immagine risultante del fluoroforo (che viene distorta dal PSF) può essere adattata con altissima precisione, anche dell'ordine di pochi Angstrom. La ripetizione del processo diverse migliaia di volte garantisce che tutti i fluorofori possano passare attraverso lo stato luminoso e vengano registrati. Un computer ricostruisce quindi un'immagine super risolta.

I tratti desiderabili dei fluorofori utilizzati per questi metodi, al fine di massimizzare la risoluzione, sono che dovrebbero essere luminosi. Cioè, dovrebbero avere un alto coefficiente di estinzione e un'alta resa quantica . Dovrebbero anche possedere un elevato rapporto di contrasto (rapporto tra il numero di fotoni emessi allo stato chiaro e il numero di fotoni emessi allo stato buio). Inoltre, è auspicabile un campione densamente etichettato, secondo i criteri di Nyquist .

La moltitudine di metodi di microscopia di localizzazione differisce principalmente nel tipo di fluorofori utilizzati.

Microscopia a distanza di precisione spettrale (SPDM)

Microscopia a super risoluzione a singola molecola YFP / SPDMphymod

Una singola, minuscola fonte di luce può essere localizzata molto meglio di quanto normalmente consentito dalla risoluzione di un microscopio: sebbene la luce produca un punto sfocato, è possibile utilizzare algoritmi informatici per calcolare con precisione il centro del punto sfocato, tenendo conto della funzione di diffusione del punto del microscopio, le proprietà di rumore del rivelatore, ecc. Tuttavia, questo approccio non funziona quando ci sono troppe sorgenti vicine l'una all'altra: le sorgenti quindi si confondono tutte insieme.

La microscopia a distanza di precisione spettrale (SPDM) è una famiglia di tecniche di localizzazione in microscopia a fluorescenza che aggira il problema dell'esistenza di molte sorgenti misurando solo poche sorgenti alla volta, in modo che ciascuna sorgente sia "isolata otticamente" dalle altre (es. , separati da più della risoluzione del microscopio, tipicamente ~200-250 nm), se le particelle in esame hanno firme spettrali diverse, in modo che sia possibile guardare la luce da poche molecole alla volta utilizzando le sorgenti luminose appropriate e filtri. Ciò consente di ottenere una risoluzione ottica effettiva molte volte migliore della risoluzione ottica convenzionale che è rappresentata dalla metà della larghezza del massimo principale della funzione di immagine del punto efficace.

La risoluzione strutturale ottenibile mediante SPDM può essere espressa in termini della minima distanza misurabile tra due particelle puntiformi di differenti caratteristiche spettrali ("risoluzione topologica"). La modellizzazione ha mostrato che in condizioni adeguate per quanto riguarda la precisione della localizzazione, la densità delle particelle, ecc., la "risoluzione topologica" corrisponde ad una " frequenza spaziale " che, nei termini della definizione classica, equivale a una risoluzione ottica molto migliorata. Le molecole possono anche essere distinte in modi ancora più sottili in base alla durata della fluorescenza e ad altre tecniche.

Un'importante applicazione è nella ricerca sul genoma (studio dell'organizzazione funzionale del genoma ). Un'altra importante area di utilizzo è la ricerca sulla struttura delle membrane.

SPDMphymod

Microscopia di localizzazione a doppio colore Microscopia SPDMphymod/super-risoluzione con proteine ​​di fusione GFP e RFP

La microscopia di localizzazione per molti coloranti fluorescenti standard come GFP , coloranti Alexa e molecole di fluoresceina è possibile se sono presenti determinate condizioni fotofisiche. Con questa cosiddetta tecnologia dei fluorofori modificabili fisicamente (SPDMphymod) , una singola lunghezza d'onda laser di intensità adeguata è sufficiente per la nanoimaging a differenza di altre tecnologie di microscopia di localizzazione che richiedono due lunghezze d'onda laser quando vengono utilizzate speciali molecole di fluorescenza foto-commutabili/foto-attivabili. Un ulteriore esempio dell'uso di SPDMphymod è un'analisi delle particelle del virus del mosaico del tabacco (TMV) o lo studio dell'interazione virus-cellula .

Sulla base delle transizioni di stato singoletto-tripletta è fondamentale per SPDMphymod che questo processo sia in corso e porti all'effetto che una singola molecola entra prima in uno stato oscuro reversibile di lunghissima vita (con emivita fino a diversi secondi) da che ritorna in uno stato fluorescente emettendo molti fotoni per diversi millisecondi prima di tornare in uno stato oscuro di lunga vita, il cosiddetto irreversibile. La microscopia SPDMphymod utilizza molecole fluorescenti che emettono la stessa frequenza di luce spettrale ma con firme spettrali diverse in base alle caratteristiche di lampeggiamento. Combinando duemila immagini della stessa cella, è possibile, utilizzando misurazioni di precisione ottica laser, registrare immagini di localizzazione con una risoluzione ottica notevolmente migliorata.

I coloranti fluorescenti standard già utilizzati con successo con la tecnologia SPDMphymod sono GFP , RFP , YFP , Alexa 488 , Alexa 568, Alexa 647, Cy2 , Cy3, Atto 488 e fluoresceina .

Localizzazione ottica criogenica in 3D (COLD)

La localizzazione ottica criogenica in tre dimensioni (COLD) consente di determinare i quattro siti di legame della biotina nella proteina streptavidina.

La localizzazione ottica criogenica in 3D (COLD) è un metodo che consente di localizzare più siti fluorescenti all'interno di una singola biomolecola di piccole e medie dimensioni con risoluzione su scala Angstrom. La precisione della localizzazione in questo approccio è migliorata perché la fotochimica più lenta a basse temperature porta a un numero maggiore di fotoni che possono essere emessi da ciascun fluoroforo prima del fotosbiancamento. Di conseguenza, la microscopia criogenica di localizzazione stocastica raggiunge la risoluzione submolecolare richiesta per risolvere le posizioni 3D di diversi fluorofori attaccati a una piccola proteina. Impiegando algoritmi noti dalla microscopia elettronica, le proiezioni 2D dei fluorofori vengono ricostruite in una configurazione 3D. COLD porta la microscopia a fluorescenza al suo limite fondamentale, a seconda delle dimensioni dell'etichetta. Il metodo può anche essere combinato con altre tecniche di biologia strutturale, come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia a risonanza magnetica e la microscopia elettronica, per fornire preziose informazioni complementari e specificità.

Microscopia di localizzazione attivata dal legame (BALM)

fBALM Microscopia di localizzazione a singola molecola a super-risoluzione utilizzando la struttura del DNA microscopia di localizzazione attivata dal legame assistito dalla fluttuazione

La microscopia di localizzazione attivata dal legame (BALM) è un concetto generale per la microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM): imaging super-risolto di coloranti che legano il DNA basato sulla modifica delle proprietà del DNA e di un colorante. Attraverso un'attenta regolazione dell'ambiente chimico, che porta alla fusione del DNA locale e reversibile e al controllo dell'ibridazione sul segnale di fluorescenza, è possibile introdurre molecole di colorante che legano il DNA. I coloranti DNA intercalanti e di legame minore possono essere utilizzati per registrare e isolare otticamente solo pochi segnali di coloranti leganti il ​​DNA alla volta. Il BALM assistito dalla fluttuazione della struttura del DNA (fBALM) è stato utilizzato per differenze su scala nanometrica nell'architettura nucleare, con una risoluzione strutturale prevista di circa 50 nm. Imaging della nanostruttura della cromatina con microscopia di localizzazione attivata dal legame basata sulle fluttuazioni della struttura del DNA. Recentemente, il significativo miglioramento della resa quantica di fluorescenza di NIAD-4 in seguito al legame a un amiloide è stata sfruttata per l'imaging BALM di fibrille amiloidi e oligomeri.

TEMPESTA, PALMA e FPALM

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM), la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM) e la microscopia a localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) sono tecniche di imaging a super risoluzione che utilizzano l'attivazione sequenziale e la localizzazione risolta nel tempo di fluorofori fotocommutabili per creare immagini ad alta risoluzione. Durante l'imaging, solo un sottoinsieme otticamente risolvibile di fluorofori viene attivato in uno stato fluorescente in un dato momento, in modo tale che la posizione di ciascun fluoroforo possa essere determinata con elevata precisione trovando le posizioni baricentriche delle immagini della singola molecola di un particolare fluoroforo. Un sottoinsieme di fluorofori viene successivamente disattivato e un altro sottoinsieme viene attivato e ripreso. L'iterazione di questo processo consente di localizzare numerosi fluorofori e di costruire un'immagine a super risoluzione dai dati dell'immagine.

Questi tre metodi sono stati pubblicati indipendentemente in un breve periodo di tempo e i loro principi sono identici. STORM è stato originariamente descritto utilizzando coloranti Cy5 e Cy3 attaccati ad acidi nucleici o proteine, mentre PALM e FPALM sono stati descritti utilizzando proteine ​​fluorescenti fotocommutabili. In linea di principio può essere utilizzato qualsiasi fluoroforo fotocommutabile e STORM è stato dimostrato con una varietà di diverse sonde e strategie di etichettatura. Utilizzando la fotocommutazione stocastica di singoli fluorofori, come Cy5, STORM può essere eseguito con una singola sorgente di eccitazione laser rossa. Il laser rosso commuta il fluoroforo Cy5 in uno stato oscuro mediante la formazione di un addotto e successivamente riporta la molecola allo stato fluorescente. Molti altri coloranti sono stati utilizzati anche con STORM.

Oltre ai singoli fluorofori, con STORM è possibile utilizzare coppie di coloranti costituite da un fluoroforo attivatore (come Alexa 405, Cy2 o Cy3) e un colorante reporter fotocommutabile (come Cy5, Alexa 647, Cy5.5 o Cy7) . In questo schema, il fluoroforo attivatore, quando eccitato vicino al suo massimo di assorbimento, serve a riattivare il colorante fotocommutabile allo stato fluorescente. L'imaging multicolore è stato eseguito utilizzando diverse lunghezze d'onda di attivazione per distinguere le coppie di coloranti, a seconda del fluoroforo attivatore utilizzato, o utilizzando fluorofori fotocommutabili spettralmente distinti, con o senza fluorofori attivatore. Possono essere utilizzate anche proteine ​​fluorescenti fotocommutabili. L'etichettatura altamente specifica delle strutture biologiche con sonde fotocommutabili è stata ottenuta con la colorazione degli anticorpi, la coniugazione diretta delle proteine ​​e la codifica genetica.

STORM è stato anche esteso all'imaging tridimensionale utilizzando l'astigmatismo ottico, in cui la forma ellittica della funzione di diffusione del punto codifica le posizioni x, yez per campioni fino a diversi micrometri di spessore, ed è stata dimostrata nelle cellule viventi. Ad oggi, la risoluzione spaziale ottenuta con questa tecnica è di ~20 nm nelle dimensioni laterali e di ~50 nm nella dimensione assiale; e la risoluzione temporale è veloce come 0,1-0,33 s.

Accumulo di punti per l'imaging in topografia su nanoscala (PAINT)

L'accumulo di punti per l'imaging nella topografia su scala nanometrica (PAINT) è un metodo di localizzazione di singola molecola che raggiunge la fluorescenza stocastica di una singola molecola mediante adsorbimento/assorbimento molecolare e fotosbiancamento/desorbimento. Il primo colorante utilizzato è stato il rosso Nilo che non è fluorescente in soluzione acquosa ma fluorescente quando inserito in un ambiente idrofobo, come micelle o pareti cellulari viventi. Pertanto, la concentrazione del colorante viene mantenuta piccola, a livello nanomolare, in modo che il tasso di assorbimento della molecola nell'area di diffrazione limitata sia nella regione del millisecondo. Il legame stocastico di molecole a colorante singolo (sonde) a un bersaglio immobilizzato può essere risolto spazialmente e temporalmente con un tipico microscopio a fluorescenza ad ampio campo. Ogni colorante viene fotosbiancato per riportare il campo in uno stato oscuro, in modo che il colorante successivo possa legarsi ed essere osservato. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri metodi stocastici, è che oltre ad ottenere l'immagine super-risolta del target fisso, può misurare la cinetica di legame dinamico delle molecole sonda diffondenti, in soluzione, al target.

Combinando la tecnica della super risoluzione 3D (ad es. la funzione di diffusione del punto a doppia elica sviluppata nel gruppo di Moerner), i coloranti fotoattivati, l'intermittenza attiva dipendente dalla potenza e l'accumulo di punti per l'imaging nella topografia su scala nanometrica, SPRAIPAINT (SPRAI=Super risoluzione di PoweR- dipendente dall'intermittenza attiva) può super-risolvere le pareti delle cellule vive. PAINT funziona mantenendo un equilibrio tra i tassi di adsorbimento/assorbimento del colorante e fotosbianca/desorbimento. Questo saldo può essere stimato con principi statistici. Il tasso di adsorbimento o assorbimento di un soluto diluito su una superficie o interfaccia in una soluzione gassosa o liquida può essere calcolato utilizzando le leggi di diffusione di Fick . Il tasso di fotosbianca/desorbimento può essere misurato per una data condizione della soluzione e densità di potenza di illuminazione.

DNA-PAINT è stato ulteriormente esteso per utilizzare coloranti regolari, in cui il legame dinamico e il distacco di una sonda di DNA marcata con colorante a un origami di DNA fisso viene utilizzato per ottenere l'imaging stocastico di una singola molecola. DNA-PAINT non è più limitato ai coloranti sensibili all'ambiente e può misurare sia l'adsorbimento che la cinetica di desorbimento delle sonde rispetto al bersaglio. Il metodo utilizza l'effetto di sfocatura della fotocamera dei coloranti in movimento. Quando un colorante normale si sta diffondendo nella soluzione, la sua immagine su una tipica telecamera CCD è sfocata a causa della sua velocità relativamente elevata e del tempo di esposizione della telecamera relativamente lungo, contribuendo allo sfondo della fluorescenza. Tuttavia, quando si lega a un bersaglio fisso, il colorante smette di muoversi; e si può ottenere un input chiaro nella funzione di diffusione puntuale.

Il termine per questo metodo è mbPAINT ("mb" sta per motion blur ). Quando viene utilizzato un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per l'imaging, la profondità di eccitazione è limitata a ~ 100 nm dal substrato, il che riduce ulteriormente lo sfondo di fluorescenza dai coloranti sfocati vicino al substrato e lo sfondo nella soluzione sfusa. Coloranti molto luminosi possono essere utilizzati per mbPAINT che fornisce tipiche risoluzioni spaziali a frame singolo di ~ 20 nm e risoluzioni temporali cinetiche a singola molecola di ~ 20 ms con intensità di fotoeccitazione relativamente lievi, utili per studiare la separazione molecolare di singole proteine.

La risoluzione temporale è stata ulteriormente migliorata (20 volte) utilizzando una maschera di fase rotazionale posizionata nel piano di Fourier durante l'acquisizione dei dati e risolvendo la funzione di diffusione del punto distorta che contiene informazioni temporali. Il metodo è stato chiamato Super Temporal-Resolved Microscopy (STReM).

Microscopia di localizzazione senza etichetta

Microscopia di localizzazione senza etichetta SPDM – La microscopia a super risoluzione rivela strutture intracellulari non rilevabili precedenti

La risoluzione ottica delle strutture cellulari nell'intervallo di circa 50 nm può essere ottenuta, anche in cellule prive di etichetta, utilizzando la microscopia di localizzazione SPDM .

Utilizzando due diverse lunghezze d'onda del laser, SPDM rivela oggetti cellulari che non sono rilevabili in condizioni di imaging a largo campo di fluorescenza convenzionali, oltre a consentire un sostanziale miglioramento della risoluzione delle strutture autofluorescenti.

Come controllo, le posizioni degli oggetti rilevati nell'immagine di localizzazione corrispondono a quelle nell'immagine in campo chiaro.

La microscopia a superrisoluzione senza etichetta è stata dimostrata anche utilizzando le fluttuazioni di un segnale di diffusione Raman potenziato dalla superficie su una metasuperficie plasmonica altamente uniforme.

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

dSTORM utilizza la fotocommutazione di un singolo fluoroforo. In dSTORM, i fluorofori sono incorporati in un sistema tampone riducente e ossidante (ROXS) e la fluorescenza è eccitata. A volte, stocasticamente, il fluoroforo entrerà in una tripletta o in qualche altro stato oscuro sensibile allo stato di ossidazione del tampone, dal quale possono essere fatti fluire, in modo da poter registrare le posizioni delle singole molecole. Lo sviluppo del metodo dSTORM è avvenuto presso 3 laboratori indipendenti all'incirca nello stesso periodo ed è stato anche chiamato "microscopia a fotosbiancamento reversibile" (RPM), "microscopia a deplezione dello stato fondamentale seguita da ritorno di singole molecole" (GSDIM), così come l'ormai generalmente accettato soprannome dSTORM.

Software per microscopia di localizzazione

La microscopia di localizzazione dipende in larga misura da un software in grado di adattare con precisione la funzione di diffusione del punto (PSF) a milioni di immagini di fluorofori attivi in ​​pochi minuti. Poiché i metodi di analisi classici e le suite software utilizzati nelle scienze naturali sono troppo lenti per risolvere questi problemi dal punto di vista computazionale, spesso impiegando ore di calcolo per elaborare dati misurati in minuti, sono stati sviluppati programmi software specializzati. Molti di questi pacchetti software di localizzazione sono open-source; sono elencati in SMLM Software Benchmark. Una volta che le posizioni delle molecole sono state determinate, le posizioni devono essere visualizzate e sono stati sviluppati diversi algoritmi per la visualizzazione.

Imaging a fluttuazione ottica a super risoluzione (SOFI)

È possibile aggirare la necessità di adattamento PSF inerente alla microscopia di localizzazione di singole molecole (SMLM) calcolando direttamente l'autocorrelazione temporale dei pixel. Questa tecnica è chiamata imaging di fluttuazione ottica a super-risoluzione (SOFI) e ha dimostrato di essere più precisa di SMLM quando la densità di fluorofori contemporaneamente attivi è molto alta.

Microscopia di localizzazione onnipresente (OLM)

Omnipresent Localization Microscopy (OLM) è un'estensione delle tecniche di Single Molecule Microscopy (SMLM) che consentono l'imaging di singole molecole ad alta densità con una sorgente di luce incoerente (come una lampada ad arco di mercurio) e una configurazione convenzionale del microscopio a epifluorescenza. Un breve burst di eccitazione deep-blue (con un laser da 350-380 nm, invece che da 405 nm) consente una riattivazione prolungata delle molecole, per una risoluzione di 90 nm sui campioni di prova. Infine, l'imaging STED e SMLM correlativo può essere eseguito sullo stesso campione biologico utilizzando un semplice mezzo di imaging, che può fornire una base per un'ulteriore risoluzione migliorata. Questi risultati possono democratizzare l'imaging a superrisoluzione e aiutare qualsiasi scienziato a generare immagini di singole molecole ad alta densità anche con un budget limitato.

Combinazione di tecniche

Microscopia di nanodimensionamento al microscopio ottico 3D (LIMON)

Microscopia 3D Dual Color Super Resolution con Her2 e Her3 nelle cellule del seno, coloranti standard: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

Le immagini di microscopia ottica nanoscopica (3D LIMON), utilizzando il microscopio Vertico SMI , sono rese possibili dalla combinazione di SMI e SPDM , per cui viene applicato prima il processo SMI e poi SPDM.

Il processo SMI determina il centro delle particelle e la loro diffusione nella direzione dell'asse del microscopio. Mentre il centro delle particelle/molecole può essere determinato con una precisione di 1–2 nm, la diffusione attorno a questo punto può essere determinata fino a un diametro assiale di circa 30–40 nm.

Successivamente, la posizione laterale della singola particella/molecola viene determinata mediante SPDM, ottenendo una precisione di pochi nanometri.

Come applicazione biologica nella modalità a doppio colore 3D, è stata ottenuta la disposizione spaziale dei cluster Her2/neu e Her3 . Le posizioni in tutte e tre le direzioni dei cluster proteici potrebbero essere determinate con una precisione di circa 25 nm.

Microscopia ottica ed elettronica correlativa integrata

La combinazione di un microscopio a super risoluzione con un microscopio elettronico consente la visualizzazione di informazioni contestuali, con l'etichettatura fornita da marcatori di fluorescenza. Questo supera il problema dello sfondo nero che rimane al ricercatore quando utilizza solo un microscopio ottico. In un sistema integrato, il campione viene misurato da entrambi i microscopi contemporaneamente.

Potenziamento delle tecniche che utilizzano le reti neurali

Recentemente, a causa dei progressi nel calcolo dell'intelligenza artificiale, le reti neurali di deep learning sono state utilizzate per il miglioramento della super-risoluzione delle immagini fotografiche al microscopio ottico, da 40x a 100x, da 20x con un microscopio ottico a 1500x, paragonabile a un microscopio elettronico a scansione , tramite una lente neurale e con tomografia a emissione di positroni e microscopia a fluorescenza.

Guarda anche

• Microscopia sul piano multifocale (MUM)
• Microscopio a riduzione dell'emissione stimolata (STED)
• Microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)
• Microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)
• deconvoluzione
• Sonde fotoattivabili
• Microscopia elettronica a luce correlativa
• Imaging ad alta risoluzione
• Super risoluzione video

Riferimenti

Ulteriori letture

• Marx V (dicembre 2013) [26 novembre 2013]. "La microscopia a super risoluzione è adatta a te?". Caratteristica tecnologica. Nature Methods (documento "Nature Reprint Collection, Technology Features"). 10 (12): 1157–63. doi : 10.1038/nmeth.2756 . PMID  24296472 . S2CID  1004998 .
• Cremer C, Master BR (aprile 2013). "Tecniche di miglioramento della risoluzione in microscopia" . Il Journal H Europea di Fisica . 38 (3): 281-344. Bibcode : 2013EPJH...38..281C . doi : 10.1140/epjh/e2012-20060-1 .