Microscopia sul piano multifocale - Multifocal plane microscopy
Multifocale microscopia piano (MUM) o microscopia Multiplane o microscopia Multifocus è una forma di luce microscopio che permette il monitoraggio della dinamica 3D in cellule vive ad alta temporale e risoluzione spaziale per l'imaging contemporaneamente diversi piani focali all'interno del campione. In questa metodologia, la luce raccolta dal campione da un obiettivo con correzione all'infinito è divisa in due percorsi. In ogni percorso la luce sdoppiata è focalizzata su un rivelatore che è posto ad una distanza calibrata specifica dalla lente del tubo. In questo modo, ogni rivelatore visualizza un piano distinto all'interno del campione. La prima configurazione MUM sviluppata era in grado di visualizzare due piani distinti all'interno del campione. Tuttavia, la configurazione può essere modificata per visualizzare più di due piani suddividendo ulteriormente la luce in ciascun percorso ottico e focalizzandola su rilevatori posizionati a distanze calibrate specifiche. In seguito è stato migliorato per l'imaging fino a quattro piani distinti. Per riprendere un numero maggiore di piani focali, sono state sviluppate tecniche più semplici basate sull'ottica di divisione dell'immagine. Un esempio è l'utilizzo di un prisma di divisione dell'immagine personalizzato, in grado di catturare fino a 8 piani focali utilizzando solo due fotocamere. Meglio ancora, i divisori di raggio parziali standard standard possono essere utilizzati per costruire un cosiddetto prisma z-splitter che consente l'imaging simultaneo di 9 singoli piani focali utilizzando una singola fotocamera. Un'altra tecnica chiamata microscopia multifocus (MFM) utilizza l'ottica diffrattiva di Fourier per visualizzare fino a 25 piani focali.
introduzione
La microscopia a fluorescenza di cellule vive rappresenta uno strumento importante nello studio degli eventi di traffico. Il design convenzionale del microscopio è ben adattato all'immagine di dinamiche cellulari veloci in due dimensioni, cioè nel piano di messa a fuoco. Tuttavia, le cellule sono oggetti tridimensionali e le vie di traffico intracellulare in genere non sono vincolate a un piano focale. Se le dinamiche non sono vincolate a un piano focale, la tecnologia convenzionale di microscopia a piano singolo è inadeguata per studi dettagliati di dinamiche intracellulari veloci in tre dimensioni. Gli approcci classici basati sul cambiamento del piano focale spesso non sono efficaci in tali situazioni poiché i dispositivi di messa a fuoco sono relativamente lenti rispetto a molte delle dinamiche intracellulari. Inoltre, il piano focale può spesso trovarsi nel posto sbagliato al momento sbagliato, perdendo così importanti aspetti degli eventi dinamici.
Implementazione
MUM può essere implementato in qualsiasi microscopio ottico standard . Un esempio di implementazione in un microscopio Zeiss è il seguente. Un adattatore dual-video Zeiss viene prima collegato alla porta laterale di un microscopio Zeiss Axiovert 200. Due adattatori dual-video Zeiss vengono quindi concatenati collegandoli alle porte di uscita del primo adattatore video Zeiss. A ciascuno degli adattatori video concatenati, è collegata una telecamera CCD ad alta risoluzione utilizzando anelli distanziatori/montaggio a C e un adattatore di accoppiamento telecamera personalizzato. La spaziatura tra la porta di uscita dell'adattatore video e la fotocamera è diversa per ciascuna fotocamera, il che si traduce nelle fotocamere che visualizzano piani focali distinti.
Vale la pena ricordare che ci sono molti modi per implementare MUM. L'implementazione menzionata offre diversi vantaggi come flessibilità, facilità di installazione e manutenzione e adattabilità per diverse configurazioni. Inoltre, per un certo numero di applicazioni è importante essere in grado di acquisire immagini in diversi colori a diversi tempi di esposizione . Ad esempio, per visualizzare l'esocitosi in TIRFM , è necessaria un'acquisizione molto rapida. Tuttavia, per visualizzare un organello stazionario marcato con fluorescenza nella cellula, è necessaria una bassa eccitazione per evitare il fotosbiancamento e, di conseguenza, l'acquisizione deve essere relativamente lenta. A questo proposito, l'implementazione di cui sopra offre una grande flessibilità, poiché è possibile utilizzare telecamere diverse per acquisire immagini in canali diversi.
Imaging 3D a super risoluzione e tracciamento di singole molecole utilizzando MUM
Le moderne tecniche di microscopia hanno generato un notevole interesse nello studio dei processi cellulari a livello di singola molecola. Gli esperimenti su singola molecola superano gli effetti della media e quindi forniscono informazioni che non sono accessibili utilizzando gli studi di massa convenzionali. Tuttavia, la localizzazione 3D e il tracciamento di singole molecole pone diverse sfide. Oltre al fatto che le immagini della singola molecola possano essere catturate o meno mentre è sottoposta a dinamiche 3D potenzialmente altamente complesse, sorge la domanda se sia possibile determinare o meno la posizione 3D della singola molecola e quanto accuratamente ciò possa essere fatto.
Uno dei principali ostacoli alla stima della posizione 3D ad alta precisione è la scarsa discriminazione della profondità di un microscopio standard. Anche con un obiettivo ad alta apertura numerica , l'immagine di una sorgente puntiforme in un microscopio convenzionale non cambia in modo apprezzabile se la sorgente puntiforme viene spostata di diverse centinaia di nanometri dalla sua posizione di messa a fuoco. Ciò rende straordinariamente difficile determinare la posizione assiale, cioè z, della sorgente puntiforme con un microscopio convenzionale.
Più in generale, la microscopia quantitativa a singola molecola per campioni 3D pone lo stesso problema sia che l'applicazione sia localizzazione/tracking o microscopia a super-risoluzione come PALM, STORM, FPALM, dSTORM per applicazioni 3D, ovvero la determinazione della posizione di una singola molecola in tre dimensioni. MUM offre diversi vantaggi. In MUM, le immagini della sorgente puntiforme vengono acquisite simultaneamente a diversi livelli di messa a fuoco. Queste immagini forniscono informazioni aggiuntive che possono essere utilizzate per vincolare la posizione z della sorgente puntiforme. Queste informazioni vincolanti superano ampiamente il problema della discriminazione della profondità vicino al fuoco.
La misura di localizzazione 3D fornisce una misura quantitativa della precisione con cui è possibile determinare la posizione della sorgente puntiforme . Un piccolo valore numerico della misura di localizzazione 3D implica un'accuratezza molto elevata nella determinazione della posizione, mentre un valore numerico elevato della misura di localizzazione 3D implica una precisione molto scarsa nella determinazione della posizione. Per un microscopio convenzionale quando la sorgente puntiforme è vicina al piano di messa a fuoco, ad esempio z0 <= 250 nm, la misura di localizzazione 3D prevede una precisione molto scarsa nella stima della posizione z. Pertanto, in un microscopio convenzionale, è problematico eseguire il tracciamento 3D quando la sorgente puntiforme è vicina al piano di messa a fuoco.
D'altra parte, per una configurazione MUM a due piani, la misura di localizzazione 3D prevede una precisione costantemente migliore rispetto a un microscopio convenzionale per una gamma di valori z, specialmente quando la sorgente puntiforme è vicina al piano di messa a fuoco. Un'implicazione immediata di questo risultato è che la posizione z della sorgente puntiforme può essere determinata con relativamente lo stesso livello di accuratezza per un intervallo di valori z, il che è favorevole per il tracciamento 3D di singole particelle .
Microscopia sul piano multifocale a doppio obiettivo (dMUM)
Nelle applicazioni di imaging a singola particella, il numero di fotoni rilevati dall'etichetta fluorescente gioca un ruolo cruciale nell'analisi quantitativa dei dati acquisiti. Attualmente, gli esperimenti di tracciamento delle particelle vengono generalmente eseguiti su un microscopio invertito o verticale, in cui una singola lente dell'obiettivo illumina il campione e raccoglie anche il segnale di fluorescenza da esso. Si noti che sebbene l'emissione di fluorescenza dal campione avvenga in tutte le direzioni (cioè, sopra e sotto il campione), l'uso di una singola lente dell'obiettivo in queste configurazioni del microscopio determina la raccolta della luce da un solo lato del campione. Anche se viene utilizzata una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica, non tutti i fotoni emessi su un lato del campione possono essere raccolti a causa dell'angolo di raccolta finito della lente dell'obiettivo. Pertanto, anche nelle migliori condizioni di imaging, i microscopi convenzionali raccolgono solo una frazione dei fotoni emessi dal campione.
Per affrontare questo problema, è possibile utilizzare una configurazione del microscopio che utilizza due obiettivi opposti, in cui uno degli obiettivi è in posizione capovolta e l'altro obiettivo è in posizione verticale. Questa configurazione è chiamata microscopia sul piano multifocale a doppio obiettivo (dMUM).