Fotosbiancamento - Photobleaching
In ottica , il photobleaching (a volte chiamato sbiadimento) è l'alterazione fotochimica di un colorante o di una molecola di fluoroforo tale che non è permanentemente in grado di emettere fluorescenza. Ciò è causato dalla scissione di legami covalenti o da reazioni non specifiche tra il fluoroforo e le molecole circostanti. Tali modifiche irreversibili nei legami covalenti sono causate dalla transizione dallo stato di singoletto allo stato di tripletto dei fluorofori. Il numero di cicli di eccitazione per ottenere uno sbiancamento completo varia. In microscopia , il fotosbiancamento può complicare l'osservazione delle molecole fluorescenti, poiché alla fine verranno distrutte dall'esposizione alla luce necessaria per stimolarle alla fluorescenza. Questo è particolarmente problematico nella microscopia time-lapse .
Tuttavia, il fotosbiancamento può anche essere utilizzato prima dell'applicazione delle molecole fluorescenti (principalmente legate all'anticorpo ), nel tentativo di spegnere l' autofluorescenza . Questo può aiutare a migliorare il rapporto segnale-rumore .
Il photobleaching può essere sfruttato anche per studiare il movimento e/o la diffusione di molecole, ad esempio tramite il FRAP , in cui il movimento dei componenti cellulari può essere confermato osservando un recupero della fluorescenza nel sito di photobleaching, o le tecniche FLIP , in cui più vengono eseguiti cicli di fotosbiancamento in modo che la diffusione della perdita di fluorescenza possa essere osservata nella cellula.
La perdita di attività causata dal fotosbiancamento può essere controllata riducendo l'intensità o l'intervallo di tempo dell'esposizione alla luce, aumentando la concentrazione di fluorofori, riducendo la frequenza e quindi l' energia fotonica della luce in ingresso, o impiegando fluorofori più robusti che sono meno inclini allo sbiancamento (es. Cyanine Dyes, Alexa Fluors o DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes e altri). Con una ragionevole approssimazione, una data molecola verrà distrutta dopo un'esposizione costante (intensità di emissione X tempo di emissione X numero di cicli) perché, in un ambiente costante, ogni ciclo di assorbimento-emissione ha la stessa probabilità di provocare il fotosbiancamento.
Il photobleaching è un parametro importante da tenere in considerazione nell'imaging a fluorescenza di singola molecola in tempo reale in biofisica. Alle intensità di luce utilizzate nell'imaging a fluorescenza a singola molecola (0,1-1 kW/cm2 nelle configurazioni sperimentali tipiche), anche i fluorofori più robusti continuano a emettere fino a 10 secondi prima del fotosbiancamento in un unico passaggio. Per alcuni coloranti, la durata può essere prolungata di 10-100 volte utilizzando sistemi di eliminazione dell'ossigeno (fino a 1000 secondi con ottimizzazione dei parametri di imaging e segnale-rumore). Ad esempio, una combinazione di acido protocatecuico (PCA) e protocatecuato 3,4-diossigenasi (PCD) viene spesso utilizzata come sistema di rimozione dell'ossigeno e ciò aumenta la durata della fluorescenza di oltre un minuto.
A seconda della loro specifica chimica, le molecole possono fotosbiancarsi dopo aver assorbito solo pochi fotoni, mentre le molecole più robuste possono subire molti cicli di assorbimento/emissione prima della distruzione:
- Proteina fluorescente verde : 10 4 –10 5 fotoni; 0,1-1,0 secondi di vita.
- Tipico colorante organico: 10 5 –10 6 fotoni; 1-10 secondi di durata.
- Punto quantico CdSe/ZnS : 10 8 fotoni; > 1.000 secondi di durata.
Questo uso del termine "durata" non deve essere confuso con la "durata" misurata dall'imaging a vita in fluorescenza .
Guarda anche
Riferimenti
link esterno
- Introduzione alla microscopia ottica un articolo sul photobleaching
- Viegas MS; Martins TC; Seco F; fare Carmo A (2007). "Una metodologia migliorata e conveniente per la riduzione dell'autofluorescenza negli studi di immunofluorescenza diretta su tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina". Eur J Histochem . 51 (1): 59-66. PMID 17548270 .