Microscopia STED - STED microscopy

La microscopia a riduzione dell'emissione stimolata (STED) fornisce miglioramenti significativi della risoluzione rispetto a quelli possibili con la microscopia confocale .

La microscopia a deplezione di emissione stimolata ( STED ) è una delle tecniche che compongono la microscopia a super risoluzione . Crea immagini a super risoluzione mediante la disattivazione selettiva dei fluorofori , riducendo al minimo l'area di illuminazione nel punto focale e migliorando così la risoluzione ottenibile per un dato sistema. È stato sviluppato da Stefan W. Hell e Jan Wichmann nel 1994 ed è stato dimostrato sperimentalmente per la prima volta da Hell e Thomas Klar nel 1999. Hell ha ricevuto il Premio Nobel per la Chimica nel 2014 per il suo sviluppo. Nel 1986, VA Okhonin (Istituto di biofisica, Accademia delle scienze dell'URSS, filiale siberiana, Krasnoyarsk) aveva brevettato l'idea STED. Questo brevetto era, forse, sconosciuto a Hell e Wichmann nel 1994.

La microscopia STED è uno dei diversi tipi di tecniche di microscopia a super risoluzione che sono state recentemente sviluppate per aggirare il limite di diffrazione della microscopia ottica per aumentare la risoluzione. STED è una tecnica funzionale deterministica che sfrutta la risposta non lineare dei fluorofori comunemente utilizzati per etichettare campioni biologici al fine di ottenere un miglioramento della risoluzione, ovvero STED consente di acquisire immagini a risoluzioni inferiori al limite di diffrazione. Ciò differisce dalle tecniche funzionali stocastiche come la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) e la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) poiché questi metodi utilizzano modelli matematici per ricostruire un limite di subdiffrazione da molti insiemi di immagini di diffrazione limitate.

Sfondo

La formula di Ernst Abbe per il limite di diffrazione, scolpita nella pietra in un monumento a Jena .
Diagramma di Jablonski che mostra il redshift del fotone stimolato. Questo redshift permette di ignorare il fotone stimolato.
Schema del design di un dispositivo STED. Il design a doppio laser consente di utilizzare insieme eccitazione ed emissione stimolata per STED.

Nella microscopia tradizionale la risoluzione ottenibile è limitata dalla diffrazione della luce . Ernst Abbe ha sviluppato un'equazione per descrivere questo limite. L'equazione è:

dove D è il limite di diffrazione, è la lunghezza d'onda della luce e NA è l' apertura numerica , ovvero l'indice di rifrazione del mezzo moltiplicato per il seno dell'angolo di incidenza. n descrive l'indice di rifrazione del campione, α misura il semiangolo solido da cui viene raccolta la luce da un obiettivo, è la lunghezza d'onda della luce utilizzata per eccitare il campione e NA è l'apertura numerica. Per ottenere un'alta risoluzione (cioè piccoli valori d), lunghezze d'onda corte e valori di NA elevati (NA = n sinα) sono ottimali. Questo limite di diffrazione è lo standard con cui vengono misurati tutti i metodi di super risoluzione. Poiché STED disattiva selettivamente la fluorescenza, può ottenere una risoluzione migliore rispetto alla tradizionale microscopia confocale. La normale fluorescenza si verifica eccitando un elettrone dallo stato fondamentale in uno stato elettronico eccitato di diverso livello di energia fondamentale (S0 va a S1) che, dopo essersi rilassato di nuovo allo stato fondamentale (di S1), emette un fotone scendendo da S1 a un livello di energia vibrazionale su S0. STED interrompe questo processo prima che il fotone venga rilasciato. L'elettrone eccitato è costretto a rilassarsi in uno stato di vibrazione superiore a quello in cui entrerebbe la transizione di fluorescenza, causando lo spostamento verso il rosso del fotone da rilasciare come mostrato nell'immagine a destra. Poiché l'elettrone sta andando in uno stato vibrazionale più elevato, la differenza di energia dei due stati è inferiore alla normale differenza di fluorescenza. Questo abbassamento di energia aumenta la lunghezza d'onda e fa sì che il fotone venga spostato più lontano nell'estremità rossa dello spettro. Questo spostamento differenzia i due tipi di fotoni e consente di ignorare il fotone stimolato.

Per forzare questa emissione alternativa, un fotone incidente deve colpire il fluoroforo. Questa necessità di essere colpita da un fotone incidente ha due implicazioni per STED. In primo luogo, il numero di fotoni incidenti influisce direttamente sull'efficienza di questa emissione e, in secondo luogo, con un numero sufficientemente elevato di fotoni la fluorescenza può essere completamente soppressa. Per ottenere il gran numero di fotoni incidenti necessari per sopprimere la fluorescenza, il laser utilizzato per generare i fotoni deve essere di alta intensità. Sfortunatamente, questo laser ad alta intensità può portare al problema del fotosbiancamento del fluoroforo. Photobleaching è il nome per la distruzione dei fluorofori da parte della luce ad alta intensità.

Processi

Confronto tra microscopia confocale e microscopia STED. Questo mostra la migliore risoluzione della microscopia STED rispetto alle tecniche tradizionali.
Punto di eccitazione (2D, a sinistra), punto di diseccitazione a forma di ciambella (al centro) e area rimanente che consente la fluorescenza (a destra).

STED funziona esaurendo la fluorescenza in regioni specifiche del campione lasciando un punto focale centrale attivo per emettere fluorescenza. Questa area focale può essere ingegnerizzata alterando le proprietà del piano pupillare della lente dell'obiettivo. Il più comune dei primi esempi di questi elementi ottici diffrattivi, o fa, è un toro di forma usato nel confinamento laterale bidimensionale mostrato sotto. La zona rossa è esaurita, mentre il punto verde è lasciato attivo. Questo DOE è generato da una polarizzazione circolare del laser a esaurimento, combinata con un vortice ottico . La risoluzione laterale di questo DOE è tipicamente compresa tra 30 e 80 nm. Tuttavia, sono stati riportati valori fino a 2,4 nm. Utilizzando diversi DOE, è stata dimostrata una risoluzione assiale dell'ordine di 100 nm. Un'equazione di Abbe modificata descrive questa risoluzione di subdiffrazione come:

Dove è l' indice di rifrazione del mezzo, è l' intensità intracavità ed è l' intensità di saturazione . Dove è il fattore di saturazione che esprime il rapporto tra l'intensità STED (massima) applicata e l'intensità di saturazione, .

Per ottimizzare l'efficacia di STED, l'interferenza distruttiva al centro del punto focale deve essere il più vicino possibile alla perfezione. Ciò impone alcuni vincoli alle ottiche che possono essere utilizzate.

coloranti

All'inizio dello sviluppo di STED, il numero di coloranti che potevano essere utilizzati nel processo era molto limitato. La rodamina B è stata nominata nella prima descrizione teorica di STED. Di conseguenza, i primi coloranti utilizzati emettevano laser nello spettro rosso. Per consentire l'analisi STED dei sistemi biologici, i coloranti e le sorgenti laser devono essere adattati al sistema. Questo desiderio di una migliore analisi di questi sistemi ha portato a cellule viventi STED e STED multicolore, ma ha anche richiesto coloranti e sistemi di eccitazione sempre più avanzati per adattarsi alla maggiore funzionalità.

Uno di questi progressi è stato lo sviluppo di cellule immunomarcate. Queste cellule sono coloranti fluorescenti STED legati agli anticorpi attraverso legami ammidici. Il primo utilizzo di questa tecnica ha accoppiato MR-121SE, un colorante rosso, con un anticorpo secondario anti-topo. Da quella prima applicazione, questa tecnica è stata applicata a una gamma molto più ampia di coloranti tra cui l'emissione di verde, Atto 532, e l'emissione di giallo, Atto 590, nonché altri coloranti ad emissione di rosso. Inoltre, Atto 647N è stato utilizzato per la prima volta con questo metodo per produrre STED a due colori.

Applicazioni

Negli ultimi anni, STED si è sviluppato da una tecnica complessa e altamente specifica a un metodo generale di fluorescenza. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi metodi per espandere l'utilità di STED e consentire la fornitura di maggiori informazioni.

Analisi strutturale

Dall'inizio del processo, STED ha consentito alla microscopia a fluorescenza di svolgere compiti che erano stati possibili solo utilizzando la microscopia elettronica. Ad esempio, STED è stato utilizzato per chiarire l'analisi della struttura proteica a livello di sub-organi. La prova comune di questo livello di studio è l'osservazione dei filamenti citoscheletrici. Inoltre, i neurofilamenti , l' actina e la tubulina sono spesso usati per confrontare il potere risolutivo di STED e microscopi confocali.

Utilizzando STED, è stata ottenuta una risoluzione laterale di 70 – 90 nm durante l'esame di SNAP25 , una proteina umana che regola la fusione della membrana. Questa osservazione ha dimostrato che SNAP25 forma cluster indipendentemente dalla funzionalità del motivo SNARE e si lega alla sintassina cluster. Anche gli studi di organelli complessi, come i mitocondri, traggono vantaggio dalla microscopia STED per l'analisi strutturale. Utilizzando microscopi STED personalizzati con una risoluzione laterale inferiore a 50 nm, è stato scoperto che le proteine ​​mitocondriali Tom20 , VDAC1 e COX2 si distribuiscono come cluster su scala nanometrica. Un altro studio ha utilizzato una microscopia STED fatta in casa e un colorante fluorescente che lega il DNA , misurando le lunghezze dei frammenti di DNA in modo molto più preciso rispetto alla misurazione convenzionale con la microscopia confocale .

Metodi correlati

A causa della sua funzione, la microscopia STED può essere spesso utilizzata con altri metodi ad alta risoluzione. La risoluzione della microscopia elettronica e a forza atomica è persino migliore della risoluzione STED, ma combinando la forza atomica con STED, Shima et al. sono stati in grado di visualizzare il citoscheletro di actina delle cellule tumorali ovariche umane osservando i cambiamenti nella rigidità cellulare.

Multicolore

Multicolor STED è stato sviluppato in risposta a un problema crescente nell'uso di STED per studiare la dipendenza tra struttura e funzione nelle proteine. Per studiare questo tipo di sistema complesso, devono essere utilizzati almeno due fluorofori separati. Utilizzando due coloranti fluorescenti e coppie di fasci, è possibile l'imaging colocalizzato di cluster proteici sinaptici e mitocondriali con una risoluzione fino a 5 nm [18]. STED multicolore è stato utilizzato anche per dimostrare che diverse popolazioni di proteine ​​delle vescicole sinaptiche non si mescolano con bottoni sinaptici di fuga. Utilizzando STED a due colori con imaging multi-vita, è possibile STED a tre canali.

Cellula viva

All'inizio si pensava che STED fosse una tecnica utile per lavorare con le cellule viventi. Sfortunatamente, l'unico modo per studiare le cellule era etichettare la membrana plasmatica con coloranti organici. La combinazione di STED con la spettroscopia di correlazione di fluorescenza ha mostrato che i complessi molecolari mediati dal colesterolo intrappolano gli sfingolipidi , ma solo transitoriamente. Tuttavia, solo le proteine ​​fluorescenti forniscono la capacità di visualizzare qualsiasi organello o proteina in una cellula vivente. Questo metodo ha dimostrato di funzionare a una risoluzione laterale di 50 nm all'interno di cellule di mammifero che esprimono citrino-tubulina. Oltre a rilevare strutture nelle cellule di mammifero, STED ha consentito la visualizzazione di proteine ​​PIN codificate con YFP in cluster nella membrana plasmatica delle cellule vegetali.

Recentemente, è stato eseguito un STED multicolore a cellule vive utilizzando un laser a impulsi rossi lontani e l'espressione di tag CLIPf e SNAPf.

Nel cervello di animali intatti

Gli strati superficiali della corteccia di topo possono essere ripresi ripetutamente attraverso una finestra cranica. Ciò consente di seguire il destino e la forma delle singole spine dendritiche per molte settimane. Con STED a due colori, è persino possibile risolvere la nanostruttura della densità postsinaptica negli animali viventi.

STED a tariffe video e oltre

La super-risoluzione richiede pixel piccoli, il che significa più spazi da acquisire in un dato campione, il che porta a un tempo di acquisizione più lungo. Tuttavia, la dimensione del punto focale dipende dall'intensità del laser utilizzato per l'esaurimento. Di conseguenza, questa dimensione dello spot può essere regolata, modificando le dimensioni e la velocità di imaging. È quindi possibile raggiungere un compromesso tra questi due fattori per ciascuna specifica attività di imaging. Sono state registrate velocità di 80 fotogrammi al secondo, con punti focali intorno ai 60 nm. È possibile raggiungere fino a 200 fotogrammi al secondo per piccoli campi visivi.

I problemi

Il fotosbiancamento può verificarsi sia dall'eccitazione in uno stato eccitato ancora più elevato, sia dall'eccitazione nello stato di tripletto. Per impedire l'eccitazione di un elettrone eccitato in un altro stato eccitato più alto, l'energia del fotone necessaria per innescare l'emissione alternativa non dovrebbe sovrapporsi all'energia dell'eccitazione da uno stato eccitato all'altro. Ciò garantirà che ogni fotone laser che viene a contatto con i fluorofori provocherà un'emissione stimolata e non indurrà l'elettrone a essere eccitato a un altro stato energetico più elevato. Gli stati di tripletta sono molto più longevi degli stati di singoletto e per evitare che gli stati di tripletto si eccitino, il tempo tra gli impulsi laser deve essere abbastanza lungo da consentire all'elettrone di rilassarsi attraverso un altro metodo di spegnimento, oppure dovrebbe essere aggiunto un composto chimico per spegnere il tripletto stato.

Guarda anche

Riferimenti

link esterno