Trasformazione (genetica) - Transformation (genetics)

In questa immagine, un gene della cellula batterica 1 viene spostato nella cellula batterica 2. Questo processo della cellula batterica 2 che assorbe nuovo materiale genetico è chiamato trasformazione.

In biologia molecolare e genetica , la trasformazione è l' alterazione genetica di una cellula risultante dall'assorbimento diretto e dall'incorporazione di materiale genetico esogeno dall'ambiente circostante attraverso la membrana o le membrane cellulari . Affinché avvenga la trasformazione, il batterio ricevente deve trovarsi in uno stato di competenza , che potrebbe verificarsi in natura come risposta limitata nel tempo a condizioni ambientali come la fame e la densità cellulare, e può anche essere indotto in laboratorio.

La trasformazione è uno dei tre processi di trasferimento genico orizzontale , in cui il materiale genetico esogeno passa da un batterio all'altro, gli altri due sono coniugazione (trasferimento di materiale genetico tra due cellule batteriche a diretto contatto) e trasduzione (iniezione di DNA estraneo da parte di un batteriofago nel batterio ospite). Nella trasformazione, il materiale genetico passa attraverso il mezzo intermedio e l'assorbimento dipende completamente dal batterio ricevente.

A partire dal 2014 era noto che circa 80 specie di batteri erano in grado di trasformarsi, circa equamente divise tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi ; il numero potrebbe essere una sopravvalutazione poiché molti dei rapporti sono supportati da singoli documenti.

"Trasformazione" può anche essere usato per descrivere l'inserimento di nuovo materiale genetico in cellule non batteriche, comprese cellule animali e vegetali; tuttavia, poiché " trasformazione " ha un significato speciale in relazione alle cellule animali, indicando la progressione verso uno stato canceroso, il processo viene solitamente chiamato " trasfezione ".

Storia

La trasformazione nei batteri fu dimostrata per la prima volta nel 1928 dal batteriologo britannico Frederick Griffith . Griffith era interessato a determinare se le iniezioni di batteri uccisi dal calore potessero essere utilizzate per vaccinare i topi contro la polmonite. Tuttavia, ha scoperto che un ceppo non virulento di Streptococcus pneumoniae potrebbe essere reso virulento dopo essere stato esposto a ceppi virulenti uccisi dal calore. Griffith ipotizzò che un qualche " principio trasformante " del ceppo ucciso dal calore fosse responsabile di rendere virulento il ceppo innocuo. Nel 1944 questo "principio trasformante" fu identificato come genetico da Oswald Avery , Colin MacLeod e Maclyn McCarty . Hanno isolato il DNA da un ceppo virulento di S. pneumoniae e usando solo questo DNA sono stati in grado di rendere virulento un ceppo innocuo. Hanno chiamato questo assorbimento e l'incorporazione di DNA da batteri "trasformazione" (vedi Esperimento di Avery ) I risultati degli esperimenti Avery et al. Sono stati in un primo momento con scetticismo ricevuto dalla comunità scientifica e non è stato fino allo sviluppo della genetica marcatori e la scoperta di altri metodi di trasferimento genetico ( coniugazione nel 1947 e trasduzione nel 1953) da parte di Joshua Lederberg che gli esperimenti di Avery furono accettati.

Originariamente si pensava che l' Escherichia coli , un organismo comunemente usato in laboratorio, fosse refrattario alla trasformazione. Tuttavia, nel 1970, Morton Mandel e Akiko Higa hanno dimostrato che l' E. coli può essere indotto a prelevare il DNA dal batteriofago senza l'uso del fago ausiliario dopo il trattamento con una soluzione di cloruro di calcio. Due anni dopo, nel 1972, Stanley Norman Cohen , Annie Chang e Leslie Hsu dimostrarono che CaCl
₂il trattamento è efficace anche per la trasformazione del DNA plasmidico. Il metodo di trasformazione di Mandel e Higa è stato successivamente migliorato da Douglas Hanahan . La scoperta della competenza indotta artificialmente in E. coli ha creato una procedura efficiente e conveniente per trasformare i batteri che consente metodi di clonazione molecolare più semplici nella biotecnologia e nella ricerca , ed è ora una procedura di laboratorio utilizzata di routine.

La trasformazione mediante elettroporazione è stata sviluppata alla fine degli anni '80, aumentando l'efficienza della trasformazione in vitro e aumentando il numero di ceppi batterici che potrebbero essere trasformati. È stata anche studiata la trasformazione delle cellule animali e vegetali con il primo topo transgenico creato iniettando un gene per un ormone della crescita di ratto in un embrione di topo nel 1982. Nel 1897 fu scoperto un batterio che causava tumori alle piante, l' Agrobacterium tumefaciens , e nei primi anni Negli anni '70 si scoprì che l'agente che induceva il tumore era un plasmide di DNA chiamato plasmide Ti . Rimuovendo i geni nel plasmide che ha causato il tumore e aggiungendo nuovi geni, i ricercatori sono stati in grado di infettare le piante con A. tumefaciens e lasciare che i batteri inserissero il DNA prescelto nei genomi delle piante. Non tutte le cellule vegetali sono suscettibili all'infezione da A. tumefaciens , quindi sono stati sviluppati altri metodi, tra cui l' elettroporazione e la microiniezione . Il bombardamento di particelle è stato reso possibile con l'invenzione del Biolistic Particle Delivery System (pistola genetica) di John Sanford negli anni '80.

Definizioni

La trasformazione è una delle tre forme di trasferimento genico orizzontale che si verificano in natura tra i batteri, in cui il DNA che codifica per un tratto passa da un batterio all'altro e viene integrato nel genoma ricevente per ricombinazione omologa ; gli altri due sono la trasduzione , effettuata per mezzo di un batteriofago , e la coniugazione , in cui un gene viene fatto passare per contatto diretto tra batteri. Nella trasformazione, il materiale genetico passa attraverso il mezzo intermedio e l'assorbimento dipende completamente dal batterio ricevente.

La competenza si riferisce a uno stato temporaneo di capacità di assorbire DNA esogeno dall'ambiente; può essere indotto in laboratorio.

Sembra essere un antico processo ereditato da un comune antenato procariotico che è un adattamento benefico per promuovere la riparazione ricombinante del danno al DNA, in particolare il danno acquisito in condizioni di stress. La trasformazione genetica naturale sembra essere un adattamento per la riparazione del danno al DNA che genera anche diversità genetica .

La trasformazione è stata studiata in specie di batteri Gram-negativi importanti dal punto di vista medico come Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae e Vibrio cholerae . È stato inoltre studiato in specie Gram-negativi trovati nel suolo come Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , e Gram-negativi pianta patogeni come Ralstonia solanacearum e Xylella fastidiosa . La trasformazione tra batteri Gram-positivi è stata studiata in specie clinicamente importanti come Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus e Streptococcus sanguinis e in batteri del suolo Gram-positivi Bacillus subtilis . È stata inoltre segnalata in almeno 30 specie di Proteobatteri distribuiti nelle classi alfa, beta, gamma ed epsilon . I proteobatteri meglio studiati rispetto alla trasformazione sono i patogeni umani clinicamente importanti Neisseria gonorrhoeae (classe beta), Haemophilus influenzae (classe gamma) e Helicobacter pylori (classe epsilon)

"Trasformazione" può anche essere usato per descrivere l'inserimento di nuovo materiale genetico in cellule non batteriche, comprese cellule animali e vegetali; tuttavia, poiché " trasformazione " ha un significato speciale in relazione alle cellule animali, indicando la progressione verso uno stato canceroso, il processo viene solitamente chiamato " trasfezione ".

Competenza naturale e trasformazione

A partire dal 2014 era noto che circa 80 specie di batteri erano in grado di trasformarsi, circa equamente divise tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi ; il numero potrebbe essere una sopravvalutazione poiché molti dei rapporti sono supportati da singoli documenti.

I batteri naturalmente competenti trasportano set di geni che forniscono il macchinario proteico per portare il DNA attraverso le membrane cellulari. Il trasporto del DNA esogeno nelle cellule può richiedere proteine ​​coinvolte nell'assemblaggio dei pili di tipo IV e del sistema di secrezione di tipo II , così come il complesso della traslocasi del DNA sulla membrana citoplasmatica.

A causa delle differenze nella struttura dell'involucro cellulare tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi, ci sono alcune differenze nei meccanismi di assorbimento del DNA in queste cellule, tuttavia la maggior parte di esse condivide caratteristiche comuni che coinvolgono proteine ​​correlate. Il DNA prima si lega alla superficie delle cellule competenti su un recettore del DNA e passa attraverso la membrana citoplasmatica tramite la traslocasi del DNA. Solo il DNA a filamento singolo può passare, l'altro filamento viene degradato dalle nucleasi nel processo. Il DNA a singolo filamento traslocato può quindi essere integrato nei cromosomi batterici mediante un processo dipendente da RecA . Nelle cellule Gram-negative, per la presenza di una membrana in più, il DNA richiede la presenza di un canale formato da secretine sulla membrana esterna. Pilin può essere richiesto per competenza, ma il suo ruolo è incerto. La captazione del DNA è generalmente non specifica per la sequenza, sebbene in alcune specie la presenza di specifiche sequenze di captazione del DNA possa facilitare un'efficace captazione del DNA.

Trasformazione naturale

La trasformazione naturale è un adattamento batterico per il trasferimento del DNA che dipende dall'espressione di numerosi geni batterici i cui prodotti sembrano essere responsabili di questo processo. In generale, la trasformazione è un processo di sviluppo complesso, che richiede energia. Affinché un batterio si leghi, assorba e ricombina il DNA esogeno nel suo cromosoma, deve diventare competente, cioè entrare in uno stato fisiologico speciale. Lo sviluppo della competenza in Bacillus subtilis richiede l'espressione di circa 40 geni. Il DNA integrato nel cromosoma ospite è solitamente (ma con rare eccezioni) derivato da un altro batterio della stessa specie, ed è quindi omologo al cromosoma residente.

In B. subtilis la lunghezza del DNA trasferito è maggiore di 1271 kb (più di 1 milione di basi). La lunghezza trasferita è probabilmente DNA a doppio filamento ed è spesso più di un terzo della lunghezza totale del cromosoma di 4215 kb. Sembra che circa il 7-9% delle cellule riceventi occupi un intero cromosoma.

La capacità di trasformazione naturale sembra verificarsi in un certo numero di procarioti e finora è noto che 67 specie procariotiche (in sette diversi phyla) subiscono questo processo.

La capacità di trasformazione è tipicamente indotta da un'elevata densità cellulare e/o limitazione nutrizionale, condizioni associate alla fase stazionaria della crescita batterica. La trasformazione in Haemophilus influenzae avviene in modo più efficiente alla fine della crescita esponenziale quando la crescita batterica si avvicina alla fase stazionaria. La trasformazione in Streptococcus mutans , così come in molti altri streptococchi, avviene ad alta densità cellulare ed è associata alla formazione di biofilm . La competenza in B. subtilis è indotta verso la fine della crescita logaritmica, specialmente in condizioni di limitazione degli aminoacidi. Allo stesso modo, in Micrococcus luteus (un rappresentante del phylum Actinobacteria meno studiato ), la competenza si sviluppa durante la fase di crescita esponenziale medio-tardiva ed è anche innescata dalla carenza di aminoacidi.

Rilasciando l'ospite intatto e il DNA plasmidico, si pensa che alcuni batteriofagi contribuiscano alla trasformazione.

Trasformazione, come adattamento per la riparazione del DNA

La competenza è specificamente indotta da condizioni di danno al DNA. Ad esempio, la trasformazione è indotta in Streptococcus pneumoniae dagli agenti dannosi per il DNA mitomicina C (un agente di reticolazione del DNA) e fluorochinolone (un inibitore della topoisomerasi che causa rotture del doppio filamento). In B. subtilis , la trasformazione è aumentata dalla luce UV, un agente dannoso per il DNA. In Helicobacter pylori , la ciprofloxacina, che interagisce con la DNA girasi e introduce rotture del doppio filamento, induce l'espressione dei geni di competenza, aumentando così la frequenza di trasformazione Utilizzando Legionella pneumophila , Charpentier et al. testato 64 molecole tossiche per determinare quali di queste inducono competenza. Di questi, solo sei, tutti agenti dannosi per il DNA, hanno causato una forte induzione. Questi agenti dannosi per il DNA erano mitomicina C (che causa legami incrociati tra i filamenti del DNA), norfloxacina, ofloxacina e acido nalidixico (inibitori della DNA girasi che causano rotture a doppio filamento), biciclomicina (causa rotture a singolo e doppio filamento) e idrossiurea (induce l'ossidazione della base del DNA). La luce UV ha anche indotto la competenza in L. pneumophila . Charpentier et al. ha suggerito che la competenza per la trasformazione probabilmente si è evoluta come una risposta al danno del DNA.

I batteri a crescita logaritmica differiscono dai batteri in fase stazionaria per quanto riguarda il numero di copie del genoma presenti nella cellula, e questo ha implicazioni per la capacità di svolgere un importante processo di riparazione del DNA . Durante la crescita logaritmica, in una cellula batterica possono essere presenti due o più copie di una particolare regione del cromosoma, poiché la divisione cellulare non è esattamente abbinata alla replicazione cromosomica. Il processo di riparazione ricombinante omologa (HRR) è un processo chiave di riparazione del DNA che è particolarmente efficace per riparare i danni del doppio filamento, come le rotture del doppio filamento. Questo processo dipende da un secondo cromosoma omologo oltre al cromosoma danneggiato. Durante la crescita logaritmica, un danno al DNA in un cromosoma può essere riparato dall'HRR utilizzando le informazioni sulla sequenza dell'altro cromosoma omologo. Una volta che le cellule si avvicinano alla fase stazionaria, tuttavia, in genere hanno solo una copia del cromosoma e l'HRR richiede l'input del modello omologo dall'esterno della cellula mediante trasformazione.

Per verificare se la funzione adattativa della trasformazione è la riparazione dei danni al DNA, sono stati condotti una serie di esperimenti utilizzando B. subtilis irradiato dalla luce UV come agente dannoso (recensito da Michod et al. e Bernstein et al.). I risultati di questi gli esperimenti hanno indicato che la trasformazione del DNA agisce per riparare i danni al DNA potenzialmente letali introdotti dalla luce UV nel DNA ricevente. Il particolare processo responsabile della riparazione era probabilmente HRR. La trasformazione nei batteri può essere vista come un processo sessuale primitivo, poiché implica l'interazione del DNA omologo di due individui per formare il DNA ricombinante che viene trasmesso alle generazioni successive. La trasformazione batterica nei procarioti potrebbe essere stato il processo ancestrale che ha dato origine alla riproduzione sessuale meiotica negli eucarioti (vedi Evoluzione della riproduzione sessuale ; Meiosi ).

Metodi e meccanismi di trasformazione in laboratorio

Schema di trasformazione batterica – per la quale deve essere prima indotta la competenza artificiale.

batterico

La competenza artificiale può essere indotta in procedure di laboratorio che comportano la permeabilità passiva della cellula al DNA esponendola a condizioni che normalmente non si verificano in natura. Tipicamente le cellule vengono incubate in una soluzione contenente cationi bivalenti (spesso cloruro di calcio ) a freddo, prima di essere esposte a un impulso di calore (shock termico). Il cloruro di calcio distrugge parzialmente la membrana cellulare, consentendo al DNA ricombinante di entrare nella cellula ospite. Le cellule che sono in grado di assorbire il DNA sono chiamate cellule competenti.

È stato scoperto che la crescita di batteri Gram-negativi in ​​20 mM Mg riduce il numero di legami proteina- lipopolisaccaride aumentando il rapporto tra legami ionici e covalenti, che aumenta la fluidità della membrana, facilitando la trasformazione. Il ruolo dei lipopolisaccaridi qui è verificato dall'osservazione che le catene O-side più corte vengono trasformate in modo più efficace, forse a causa della migliore accessibilità del DNA.

La superficie di batteri come E. coli è caricata negativamente a causa di fosfolipidi e lipopolisaccaridi sulla sua superficie cellulare, e anche il DNA è caricato negativamente. Una funzione del catione bivalente sarebbe quindi quella di schermare le cariche coordinando i gruppi fosfato e altre cariche negative, consentendo così a una molecola di DNA di aderire alla superficie cellulare.

L'ingresso del DNA nelle cellule di E. coli avviene attraverso canali noti come zone di adesione o giunzione di Bayer, con una cellula tipica che trasporta fino a 400 di tali zone. Il loro ruolo è stato stabilito quando è stato scoperto che la cobalamina (che utilizza anche questi canali) inibisce in modo competitivo l'assorbimento del DNA. Un altro tipo di canale implicato nell'assorbimento del DNA è costituito da poli (HB): poli P: Ca. In questo poli (HB) è previsto che avvolga il DNA (a sua volta un polifosfato) ed è trasportato in uno scudo formato da ioni Ca.

Si suggerisce che l'esposizione delle cellule a cationi bivalenti in condizioni di freddo possa anche modificare o indebolire la struttura della superficie cellulare, rendendola più permeabile al DNA. Si pensa che l'impulso di calore crei uno squilibrio termico attraverso la membrana cellulare, che costringe il DNA ad entrare nelle cellule attraverso i pori cellulari o la parete cellulare danneggiata.

L'elettroporazione è un altro metodo per promuovere la competenza. In questo metodo le cellule vengono brevemente sottoposte a shock con un campo elettrico di 10-20 kV /cm, che si ritiene crei fori nella membrana cellulare attraverso i quali può entrare il DNA plasmidico. Dopo lo shock elettrico, i fori vengono rapidamente chiusi dai meccanismi di riparazione della membrana cellulare.

Lievito

La maggior parte delle specie di lievito , compreso Saccharomyces cerevisiae , può essere trasformata dal DNA esogeno nell'ambiente. Sono stati sviluppati diversi metodi per facilitare questa trasformazione ad alta frequenza in laboratorio.

• Le cellule di lievito possono essere trattate con enzimi per degradare le loro pareti cellulari, producendo sferoplasti . Queste cellule sono molto fragili ma assorbono il DNA estraneo ad un ritmo elevato.
• L'esposizione delle cellule di lievito intatte a cationi alcalini come quelli del cesio o del litio consente alle cellule di assorbire il DNA plasmidico. I protocolli successivi hanno adattato questo metodo di trasformazione, utilizzando acetato di litio , glicole polietilenico e DNA a filamento singolo. In questi protocolli, il DNA a singolo filamento si lega preferenzialmente alla parete cellulare del lievito, impedendo al DNA plasmidico di farlo e lasciandolo disponibile per la trasformazione.
• Elettroporazione : formazione di fori transitori nelle membrane cellulari mediante scosse elettriche; questo consente al DNA di entrare come descritto sopra per i batteri.
• La digestione enzimatica o l'agitazione con perline di vetro possono anche essere utilizzate per trasformare le cellule di lievito.

Efficienza - Diversi generi e specie di lievito assorbono DNA estraneo con diverse efficienze. Inoltre, la maggior parte dei protocolli di trasformazione sono stati sviluppati per il lievito di birra, S. cerevisiae , e quindi potrebbe non essere ottimale per altre specie. Anche all'interno di una specie, ceppi diversi hanno efficienze di trasformazione diverse, a volte diverse di tre ordini di grandezza. Ad esempio, quando i ceppi di S. cerevisiae sono stati trasformati con 10 ug di plasmide YEp13, il ceppo DKD-5D-H ha prodotto tra 550 e 3115 colonie mentre il ceppo OS1 ha prodotto meno di cinque colonie.

Impianti

Sono disponibili numerosi metodi per trasferire il DNA nelle cellule vegetali. Alcuni metodi mediati da vettori sono:

• La trasformazione mediata da Agrobacterium è la trasformazione della pianta più semplice e più semplice. Il tessuto vegetale (spesso le foglie) viene tagliato in piccoli pezzi, ad es. 10x10 mm, e immerso per dieci minuti in un fluido contenente Agrobacterium sospeso. I batteri si attaccheranno a molte delle cellule vegetali esposte dal taglio. Le cellule vegetali secernono composti fenolici correlati alla ferita che a loro volta agiscono per sovraregolare la virulenza dell'operone dell'Agrobacterium. L'operone di virulenza include molti geni che codificano per proteine ​​che fanno parte di un sistema di secrezione di tipo IV che esporta dal batterio proteine ​​e DNA (delineati da specifici motivi di riconoscimento chiamati sequenze di confine ed escisse come un singolo filamento dal plasmide di virulenza) nella pianta cellula attraverso una struttura chiamata pilus. Il DNA trasferito (chiamato T-DNA) viene pilotato al nucleo della cellula vegetale da segnali di localizzazione nucleare presenti nella proteina Agrobacterium VirD2, che è attaccata covalentemente all'estremità del T-DNA al margine destro (RB). Il modo esatto in cui il T-DNA è integrato nel DNA genomico della pianta ospite è un'area attiva della ricerca sulla biologia vegetale. Supponendo che un marcatore di selezione (come un gene di resistenza agli antibiotici) sia stato incluso nel T-DNA, il tessuto vegetale trasformato può essere coltivato su terreni selettivi per produrre germogli. I germogli vengono quindi trasferiti in un mezzo diverso per promuovere la formazione delle radici. Una volta che le radici iniziano a crescere dal germoglio transgenico, le piante possono essere trasferite nel terreno per completare un normale ciclo di vita (produrre semi). I semi di questa prima pianta (chiamata T1, per la prima generazione transgenica) possono essere piantati su un terreno selettivo (contenente un antibiotico), oppure se è stato utilizzato un gene di resistenza agli erbicidi, potrebbero in alternativa essere piantati nel terreno, quindi successivamente trattati con erbicida per uccidere i segreganti selvatici. Alcune specie vegetali, come l' Arabidopsis thaliana, possono essere trasformate per immersione dei fiori o della pianta intera, in una sospensione di Agrobacterium tumefaciens , tipicamente ceppo C58 (C=Cherry, 58=1958, anno in cui questo particolare ceppo di A. tumefaciens è stato isolato da un ciliegio in un frutteto alla Cornell University di Ithaca, New York). Sebbene molte piante rimangano recalcitranti alla trasformazione con questo metodo, sono in corso ricerche che continuano ad aggiungere all'elenco le specie che sono state modificate con successo in questo modo.
• Trasformazione virale ( trasduzione ): impacchettare il materiale genetico desiderato in un virus vegetale adatto e consentire a questo virus modificato di infettare la pianta. Se il materiale genetico è DNA, può ricombinarsi con i cromosomi per produrre cellule trasformanti. Tuttavia, i genomi della maggior parte dei virus delle piante sono costituiti da RNA a singolo filamento che si replica nel citoplasma della cellula infetta. Per tali genomi questo metodo è una forma di trasfezione e non una vera e propria trasformazione, poiché i geni inseriti non raggiungono mai il nucleo della cellula e non si integrano nel genoma ospite. La progenie delle piante infette è esente da virus e anche priva del gene inserito.

Alcuni metodi senza vettori includono:

• Pistola genetica : chiamata anche bombardamento di particelle, bombardamento di microproiettili o biolitica. Le particelle d'oro o di tungsteno vengono ricoperte di DNA e quindi sparate in cellule vegetali giovani o embrioni vegetali. Parte del materiale genetico rimarrà nelle cellule e le trasformerà. Questo metodo consente anche la trasformazione dei plastidi vegetali. L' efficienza di trasformazione è inferiore rispetto alla trasformazione mediata da Agrobacterium , ma la maggior parte delle piante può essere trasformata con questo metodo.
• Elettroporazione : formazione di fori transitori nelle membrane cellulari mediante impulsi elettrici ad alta intensità di campo; ciò consente al DNA di entrare come descritto sopra per i batteri.

Fungo

Esistono alcuni metodi per produrre funghi transgenici, la maggior parte dei quali sono analoghi a quelli utilizzati per le piante. Tuttavia, i funghi devono essere trattati in modo diverso a causa di alcune delle loro caratteristiche microscopiche e biochimiche:

• Un problema importante è lo stato dicariotico in cui si trovano parti di alcuni funghi; le cellule dicariotiche contengono due nuclei aploidi, uno per ciascun fungo genitore. Se solo uno di questi si trasforma, che è la regola, la percentuale di nuclei trasformati diminuisce dopo ogni sporulazione .
• Le pareti delle cellule fungine sono piuttosto spesse e ostacolano l'assorbimento del DNA, quindi è spesso necessaria la rimozione (parziale); la completa degradazione, che a volte è necessaria, produce protoplasti .
• I funghi miceliali sono costituiti da ife filamentose , che sono, se non del tutto, separate da pareti cellulari interne interrotte da pori abbastanza grandi da consentire ai nutrienti e agli organelli, a volte anche ai nuclei, di viaggiare attraverso ciascuna ifa. Di conseguenza, le singole celle di solito non possono essere separate. Ciò è problematico poiché le cellule trasformate vicine possono rendere immuni ai trattamenti di selezione quelle non trasformate, ad esempio fornendo nutrienti o proteine ​​per la resistenza agli antibiotici.
• Inoltre, la crescita (e quindi la mitosi) di questi funghi si verifica esclusivamente sulla punta delle loro ife, il che può anche causare problemi.

Come affermato in precedenza, una serie di metodi utilizzati per la trasformazione delle piante funziona anche nei funghi:

• L'Agrobacterium non è solo in grado di infettare le piante ma anche i funghi, tuttavia, a differenza delle piante, i funghi non secernono i composti fenolici necessari per innescare l'Agrobacterium quindi devono essere aggiunti, ad esempio sotto forma di acetosiringone .
• Grazie allo sviluppo di un sistema di espressione per piccoli RNA nei funghi è diventata possibile l'introduzione di un sistema CRISPR/CAS9 nelle cellule fungine. Nel 2016 l'USDA ha dichiarato che non regolerà un ceppo di fungo pulsante bianco modificato con CRISPR/CAS9 per prevenire l'imbrunimento del corpo del frutto, causando un'ampia discussione sull'immissione sul mercato di colture modificate con CRISPR/CAS9.
• Metodi fisici come l'elettroporazione, la biolistica ("pistola genetica"), la sonoporazione che utilizza la cavitazione di bolle di gas prodotte dagli ultrasuoni per penetrare nella membrana cellulare, ecc. Sono applicabili anche ai funghi.

Animali

L'introduzione del DNA nelle cellule animali è solitamente chiamata trasfezione ed è discussa nell'articolo corrispondente.

Aspetti pratici della trasformazione in biologia molecolare

La scoperta della competenza indotta artificialmente nei batteri consente a batteri come l' Escherichia coli di essere utilizzati come ospite conveniente per la manipolazione del DNA e per l'espressione delle proteine. Tipicamente i plasmidi sono usati per la trasformazione in E. coli . Per essere mantenuta stabilmente nella cellula, una molecola di DNA plasmidico deve contenere un'origine di replicazione , che gli permetta di essere replicata nella cellula indipendentemente dalla replicazione del cromosoma della cellula.

L'efficienza con cui una coltura competente può assorbire il DNA esogeno ed esprimere i suoi geni è nota come efficienza di trasformazione e si misura in unità formanti colonie (ufc) per μg di DNA utilizzato. Un'efficienza di trasformazione di 1×10 ⁸ cfu/μg per un piccolo plasmide come pUC19 è approssimativamente equivalente a 1 su 2000 molecole del plasmide utilizzato in trasformazione.

Nella trasformazione del cloruro di calcio , le cellule vengono preparate raffreddando le cellule in presenza di Ca²⁺
(in CaCl
₂soluzione), rendendo la cellula permeabile al DNA plasmidico . Le cellule vengono incubate su ghiaccio con il DNA e quindi brevemente sottoposte a shock termico (ad es. a 42 °C per 30-120 secondi). Questo metodo funziona molto bene per il DNA plasmidico circolare. Le preparazioni non commerciali dovrebbero normalmente dare da 10 ⁶ a 10 ⁷ trasformanti per microgrammo di plasmide; una preparazione scadente sarà di circa 10 ⁴ /μg o meno, ma una buona preparazione di cellule competenti può dare fino a ~ 10 ⁸ colonie per microgrammo di plasmide. Tuttavia, esistono protocolli per creare cellule supercompetenti che possono produrre un'efficienza di trasformazione superiore a 10 ⁹ . Il metodo chimico, tuttavia, di solito non funziona bene per il DNA lineare, come i frammenti di DNA cromosomico, probabilmente perché gli enzimi esonucleasi nativi della cellula degradano rapidamente il DNA lineare. Al contrario, le cellule che sono naturalmente competenti vengono solitamente trasformate in modo più efficiente con il DNA lineare che con il DNA plasmidico.

L'efficienza di trasformazione utilizzando il CaCl
₂Il metodo diminuisce con la dimensione del plasmide e quindi l'elettroporazione può essere un metodo più efficace per l'assorbimento di DNA plasmidico di grandi dimensioni. Le cellule utilizzate nell'elettroporazione devono essere prima preparate lavandole in acqua fredda bidistillata per rimuovere le particelle cariche che possono creare scintille durante il processo di elettroporazione.

Selezione e screening nella trasformazione dei plasmidi

Poiché la trasformazione di solito produce una miscela di relativamente poche cellule trasformate e un'abbondanza di cellule non trasformate, è necessario un metodo per selezionare le cellule che hanno acquisito il plasmide. Il plasmide pertanto richiede un marcatore selezionabile tale che quelle cellule senza il plasmide possano essere uccise o arrestare la loro crescita. La resistenza agli antibiotici è il marker più comunemente usato per i procarioti. Il plasmide trasformante contiene un gene che conferisce resistenza a un antibiotico a cui i batteri sono altrimenti sensibili. La miscela di cellule trattate viene coltivata su terreni che contengono l'antibiotico in modo che solo le cellule trasformate possano crescere. Un altro metodo di selezione è l'uso di alcuni marcatori auxotrofici che possono compensare l'incapacità di metabolizzare determinati amminoacidi, nucleotidi o zuccheri. Questo metodo richiede l'uso di ceppi opportunamente mutati che sono carenti nella sintesi o nell'utilità di una particolare biomolecola e le cellule trasformate vengono coltivate in un mezzo che consente la crescita solo delle cellule contenenti il ​​plasmide.

In un esperimento di clonazione, un gene può essere inserito in un plasmide utilizzato per la trasformazione. Tuttavia, in tale esperimento, non tutti i plasmidi possono contenere un gene inserito con successo. Ulteriori tecniche possono quindi essere impiegate ulteriormente per lo screening di cellule trasformate che contengono plasmide con l'inserto. I geni reporter possono essere usati come marcatori , come il gene lacZ che codifica per la -galattosidasi utilizzata nello screening blu-bianco . Questo metodo di screening si basa sul principio dell'α- complementazione , in cui un frammento del gene lacZ ( lacZα ) nel plasmide può completare un altro gene lacZ mutante ( lacZΔM15 ) nella cellula. Entrambi i geni producono da soli peptidi non funzionali, tuttavia, quando espressi insieme, come quando un plasmide contenente lacZ-α viene trasformato in cellule lacZΔM15 , formano una -galattosidasi funzionale. La presenza di una β-galattosidasi attiva può essere rilevata quando le cellule vengono coltivate in piastre contenenti X-gal , formando caratteristiche colonie blu. Tuttavia, il sito di clonazione multiplo , dove un gene di interesse può essere ligato nel vettore plasmidico , si trova all'interno del gene lacZα . La legatura di successo interrompe quindi il gene lacZα e non può formarsi alcuna β-galattosidasi funzionale, con conseguente colonie bianche. Le cellule che contengono un inserto legato con successo possono quindi essere facilmente identificate dalla sua colorazione bianca da quelle blu che non hanno successo.

Altri geni reporter comunemente usati sono la proteina fluorescente verde (GFP), che produce cellule che brillano di verde sotto la luce blu, e l'enzima luciferasi , che catalizza una reazione con la luciferina per emettere luce. Il DNA ricombinante può anche essere rilevato usando altri metodi come l'ibridazione dell'acido nucleico con la sonda di RNA radioattivo, mentre le cellule che hanno espresso la proteina desiderata dal plasmide possono anche essere rilevate usando metodi immunologici.

Riferimenti

link esterno

• Trasformazione batterica ( un'animazione Flash)
• "Pronti mirare fuoco!" Al Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology a Potsdam-Golm le cellule vegetali vengono "bombardate" con una pistola a particelle