Microscopio - Microscope

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Microscopio
Microscopio composto (ritagliato) .JPG
Microscopio
Utilizza Osservazione di piccoli campioni
Notevoli esperimenti Scoperta delle cellule
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Un microscopio (dal greco antico : μικρός , mikrós , "piccolo" e σκοπεῖν , skopeîn , "guardare" o "vedere") è uno strumento di laboratorio utilizzato per esaminare oggetti troppo piccoli per essere visti ad occhio nudo . La microscopia è la scienza che studia piccoli oggetti e strutture usando un microscopio. Microscopico significa essere invisibile agli occhi se non aiutato da un microscopio.

Esistono molti tipi di microscopi e possono essere raggruppati in modi diversi. Un modo è descrivere il metodo utilizzato da uno strumento per interagire con un campione e produrre immagini, inviando un fascio di luce o elettroni attraverso un campione nel suo percorso ottico , rilevando le emissioni di fotoni da un campione o scansionando attraverso e un a breve distanza dalla superficie di un campione utilizzando una sonda. Il microscopio più comune (e il primo ad essere inventato) è il microscopio ottico , che utilizza lenti per rifrangere la luce visibile che è passata attraverso un campione a sezione sottile per produrre un'immagine osservabile. Altri principali tipi di microscopi sono il microscopio a fluorescenza , il microscopio elettronico (sia il microscopio elettronico a trasmissione che il microscopio elettronico a scansione ) e vari tipi di microscopi con sonda a scansione .

Storia

Microscopi del XVIII secolo del Musée des Arts et Métiers , Parigi

Sebbene oggetti simili a lenti risalgano a 4.000 anni fa e ci siano resoconti greci delle proprietà ottiche delle sfere piene d'acqua (V secolo a.C.) seguiti da molti secoli di scritti sull'ottica, il primo uso conosciuto di semplici microscopi ( lenti d'ingrandimento ) risale a l'uso diffuso di lenti negli occhiali nel XIII secolo. I primi esempi noti di microscopi composti, che combinano una lente dell'obiettivo vicino al campione con un oculare per visualizzare un'immagine reale , apparvero in Europa intorno al 1620. L'inventore è sconosciuto sebbene molte affermazioni siano state fatte nel corso degli anni. Diversi ruotano attorno ai centri di produzione di spettacoli nei Paesi Bassi, comprese le affermazioni che è stato inventato nel 1590 da Zacharias Janssen (affermazione fatta da suo figlio) e / o il padre di Zaccaria, Hans Martens, afferma che è stato inventato dal loro vicino e produttore di spettacoli rivale Hans Lippershey (che hanno applicato per la prima telescopio di brevetto nel 1608), e sostiene che è stato inventato da espatriato Cornelis Drebbel che è stato notato di avere una versione a Londra nel 1619. Galileo Galilei (anche a volte citato come composto inventore del microscopio) sembra aver trovato dopo il 1610 che poteva mettere a fuoco il suo telescopio per visualizzare piccoli oggetti e, dopo aver visto un microscopio composto costruito da Drebbel esposto a Roma nel 1624, costruì la sua versione migliorata. Giovanni Faber ha coniato il nome del microscopio per il microscopio composto Galileo presentato alla Accademia dei Lincei nel 1625 (Galileo aveva chiamato il " occhiolino " o " piccolo occhio ").

Ascesa dei moderni microscopi ottici

Microscopio binoculare composto Carl Zeiss, 1914

Il primo resoconto dettagliato della anatomia microscopica di tessuto organico basato sull'uso di un microscopio non sembra fino 1644, in Giambattista Odierna L'occhio della mosca , o degli occhi della mosca .

Il microscopio era ancora in gran parte una novità fino al 1660 e 1670 quando i naturalisti in Italia, Paesi Bassi e Inghilterra iniziarono a usarli per studiare biologia. Lo scienziato italiano Marcello Malpighi , chiamato il padre dell'istologia da alcuni storici della biologia, iniziò la sua analisi delle strutture biologiche con i polmoni. La pubblicazione nel 1665 di Robert Hooke s' Micrographia ha avuto un impatto enorme, soprattutto a causa delle sue imponenti illustrazioni. Un contributo significativo è venuto da Antonie van Leeuwenhoek che ha ottenuto un ingrandimento fino a 300 volte utilizzando un semplice microscopio a lente singola. Ha inserito una lente a sfera di vetro molto piccola tra i fori di due piastre metalliche rivettate insieme e con un ago regolabile mediante viti attaccato per montare il campione. Quindi, Van Leeuwenhoek ha riscoperto i globuli rossi (dopo Jan Swammerdam ) e gli spermatozoi e ha contribuito a rendere popolare l'uso dei microscopi per visualizzare l'ultrastruttura biologica. Il 9 ottobre 1676, van Leeuwenhoek riferì della scoperta di microrganismi.

Le prestazioni di un microscopio ottico dipendono dalla qualità e dal corretto utilizzo del sistema di lenti a condensatore per focalizzare la luce sul campione e l'obiettivo per catturare la luce dal campione e formare un'immagine. I primi strumenti furono limitati fino a quando questo principio non fu pienamente apprezzato e sviluppato dalla fine del XIX all'inizio del XX secolo e fino a quando le lampade elettriche non furono disponibili come sorgenti luminose. Nel 1893 August Köhler sviluppò un principio chiave dell'illuminazione del campione, l'illuminazione Köhler , che è fondamentale per raggiungere i limiti teorici di risoluzione per il microscopio ottico. Questo metodo di illuminazione del campione produce un'illuminazione uniforme e supera il contrasto e la risoluzione limitati imposti dalle prime tecniche di illuminazione del campione. Ulteriori sviluppi nell'illuminazione dei campioni vennero dalla scoperta del contrasto di fase da parte di Frits Zernike nel 1953 e dell'illuminazione a contrasto di interferenza differenziale da Georges Nomarski nel 1955; entrambi consentono l'imaging di campioni trasparenti e non colorati.

Microscopi elettronici

Microscopio elettronico costruito da Ernst Ruska nel 1933

All'inizio del XX secolo è stata sviluppata un'alternativa significativa al microscopio ottico, uno strumento che utilizza un fascio di elettroni anziché la luce per generare un'immagine. Il fisico tedesco Ernst Ruska , in collaborazione con l'ingegnere elettrico Max Knoll , sviluppò il primo prototipo di microscopio elettronico nel 1931, un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Il microscopio elettronico a trasmissione funziona secondo principi simili a un microscopio ottico ma utilizza elettroni al posto della luce ed elettromagneti al posto delle lenti di vetro. L'uso di elettroni, invece della luce, consente una risoluzione molto più elevata.

Lo sviluppo del microscopio elettronico a trasmissione fu rapidamente seguito nel 1935 dallo sviluppo del microscopio elettronico a scansione di Max Knoll . Sebbene i TEM siano stati utilizzati per la ricerca prima della seconda guerra mondiale e siano diventati popolari in seguito, il SEM non era disponibile in commercio fino al 1965.

I microscopi elettronici a trasmissione divennero popolari dopo la seconda guerra mondiale . Ernst Ruska, che lavorava in Siemens , sviluppò il primo microscopio elettronico a trasmissione commerciale e, negli anni '50, iniziarono a tenersi importanti conferenze scientifiche sulla microscopia elettronica. Nel 1965, il primo microscopio elettronico a scansione commerciale fu sviluppato dal professor Sir Charles Oatley e dal suo studente post-laurea Gary Stewart, e commercializzato dalla Cambridge Instrument Company come "Stereoscan".

Una delle ultime scoperte fatte sull'uso di un microscopio elettronico è la capacità di identificare un virus. Poiché questo microscopio produce un'immagine chiara e visibile di piccoli organelli, in un microscopio elettronico non sono necessari reagenti per vedere il virus o le cellule nocive, risultando in un modo più efficiente per rilevare i patogeni.

Microscopi a sonda a scansione

Dal 1981 al 1983 Gerd Binnig e Heinrich Rohrer hanno lavorato presso l' IBM a Zurigo , in Svizzera , per studiare il fenomeno del tunneling quantistico . Hanno creato uno strumento pratico, un microscopio a sonda a scansione dalla teoria del tunneling quantistico, che legge le forze molto piccole scambiate tra una sonda e la superficie di un campione. La sonda si avvicina alla superficie così da vicino che gli elettroni possono fluire continuamente tra la sonda e il campione, creando una corrente dalla superficie alla sonda. Il microscopio non è stato inizialmente ben accolto a causa della natura complessa delle spiegazioni teoriche sottostanti. Nel 1984 Jerry Tersoff e DR Hamann, mentre erano ai Bell Laboratories dell'AT & T a Murray Hill, nel New Jersey, iniziarono a pubblicare articoli che legavano la teoria ai risultati sperimentali ottenuti dallo strumento. Questo fu seguito da vicino nel 1985 con strumenti commerciali funzionanti, e nel 1986 con l'invenzione di Gerd Binnig, Quate e Gerber del microscopio a forza atomica , poi il premio Nobel per la fisica di Binnig e Rohrer per l'SPM.

Nuovi tipi di microscopi con sonda a scansione hanno continuato a essere sviluppati man mano che la capacità di lavorare sonde e punte ultrafini è avanzata.

Microscopi a fluorescenza

Microscopio a fluorescenza con torretta del cubo del filtro sopra le lenti dell'obiettivo, accoppiato a una telecamera.

Gli sviluppi più recenti nel microscopio ottico sono in gran parte incentrati sull'aumento della microscopia a fluorescenza in biologia . Durante gli ultimi decenni del XX secolo, in particolare nell'era postgenomica , sono state sviluppate molte tecniche per la colorazione fluorescente delle strutture cellulari . I principali gruppi di tecniche riguardano la colorazione chimica mirata di particolari strutture cellulari, ad esempio il composto chimico DAPI per etichettare il DNA , l'uso di anticorpi coniugati a reporter fluorescenti, vedere immunofluorescenza e proteine ​​fluorescenti, come la proteina fluorescente verde . Queste tecniche utilizzano questi diversi fluorofori per l'analisi della struttura cellulare a livello molecolare in campioni sia vivi che fissi.

L'ascesa della microscopia a fluorescenza ha guidato lo sviluppo di un importante design moderno del microscopio, il microscopio confocale . Il principio fu brevettato nel 1957 da Marvin Minsky , sebbene la tecnologia laser limitasse l'applicazione pratica della tecnica. Fu solo nel 1978 quando Thomas e Christoph Cremer svilupparono il primo pratico microscopio confocale a scansione laser e la tecnica guadagnò rapidamente popolarità negli anni '80.

Microscopi a super risoluzione

Gran parte della ricerca attuale (all'inizio del 21 ° secolo) sulle tecniche del microscopio ottico è focalizzata sullo sviluppo dell'analisi di super - risoluzione di campioni marcati con fluorescenza. L'illuminazione strutturata può migliorare la risoluzione di circa due o quattro volte e tecniche come la microscopia a riduzione delle emissioni stimolate (STED) si stanno avvicinando alla risoluzione dei microscopi elettronici. Ciò si verifica perché il limite di diffrazione si verifica dalla luce o dall'eccitazione, il che fa sì che la risoluzione debba essere raddoppiata per diventare super satura. Stefan Hell è stato insignito del Premio Nobel 2014 per la chimica per lo sviluppo della tecnica STED, insieme a Eric Betzig e William Moerner che hanno adattato la microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di singole molecole.

Microscopi a raggi X.

I microscopi a raggi X sono strumenti che utilizzano la radiazione elettromagnetica di solito nella banda morbida dei raggi X per visualizzare gli oggetti. I progressi tecnologici nell'ottica delle lenti a raggi X nei primi anni '70 hanno reso lo strumento una valida scelta di imaging. Sono spesso usati in tomografia (vedi tomografia microcomputerizzata ) per produrre immagini tridimensionali di oggetti, inclusi materiali biologici che non sono stati fissati chimicamente. Attualmente sono in corso ricerche per migliorare l'ottica per i raggi X duri che hanno un maggiore potere di penetrazione.

Tipi

Tipi di microscopi illustrati dai principi dei loro percorsi ottici
Evoluzione della risoluzione spaziale ottenuta con microscopi elettronici ottici, di trasmissione (TEM) e con correzione dell'aberrazione (ACTEM).

I microscopi possono essere suddivisi in diverse classi. Un raggruppamento si basa su ciò che interagisce con il campione per generare l'immagine, ovvero luce o fotoni (microscopi ottici), elettroni (microscopi elettronici) o una sonda (microscopi con sonda a scansione). In alternativa, i microscopi possono essere classificati in base al fatto che analizzano il campione tramite un punto di scansione (microscopi ottici confocali, microscopi elettronici a scansione e microscopi con sonda a scansione) o analizzano il campione tutto in una volta (microscopi ottici a campo ampio e microscopi elettronici a trasmissione).

Sia i microscopi ottici a largo campo che i microscopi elettronici a trasmissione utilizzano la teoria delle lenti ( ottica per microscopi ottici e lenti elettromagnetiche per microscopi elettronici) per ingrandire l'immagine generata dal passaggio di un'onda trasmessa attraverso il campione, o riflessa dal campione. Le onde utilizzate sono elettromagnetiche (nei microscopi ottici ) o fasci di elettroni (nei microscopi elettronici ). La risoluzione in questi microscopi è limitata dalla lunghezza d'onda della radiazione utilizzata per visualizzare il campione, dove lunghezze d'onda più corte consentono una risoluzione maggiore.

I microscopi ottici ed elettronici a scansione, come il microscopio confocale e il microscopio elettronico a scansione, utilizzano lenti per focalizzare un punto di luce o elettroni sul campione, quindi analizzano i segnali generati dal raggio che interagisce con il campione. Il punto viene quindi scansionato sul campione per analizzare una regione rettangolare. L'ingrandimento dell'immagine si ottiene visualizzando i dati dalla scansione di un'area campione fisicamente piccola su uno schermo relativamente grande. Questi microscopi hanno lo stesso limite di risoluzione dei microscopi ottici, a sonda ed elettronici ad ampio campo.

I microscopi con sonda a scansione analizzano anche un singolo punto nel campione e quindi scansionano la sonda su una regione del campione rettangolare per costruire un'immagine. Poiché questi microscopi non utilizzano radiazioni elettromagnetiche o elettroniche per l'imaging, non sono soggetti allo stesso limite di risoluzione dei microscopi ottici ed elettronici sopra descritti.

Ottico

Il tipo più comune di microscopio (e il primo inventato) è il microscopio ottico . Questo è uno strumento ottico contenente una o più lenti che producono un'immagine ingrandita di un campione posto sul piano focale. I microscopi ottici hanno un vetro rifrangente (occasionalmente di plastica o quarzo ), per focalizzare la luce sull'occhio o su un altro rilevatore di luce. I microscopi ottici a specchio funzionano allo stesso modo. L'ingrandimento tipico di un microscopio ottico, supponendo che la luce del campo visibile, sia fino a 1250x con un limite di risoluzione teorico di circa 0,250  micrometri o 250  nanometri . Questo limita l'ingrandimento pratico a ~ 1500x. Le tecniche specializzate (p. Es., Microscopia confocale a scansione , Vertico SMI ) possono superare questo ingrandimento ma la risoluzione è limitata dalla diffrazione . L'uso di lunghezze d'onda della luce più corte, come l'ultravioletto, è un modo per migliorare la risoluzione spaziale del microscopio ottico, così come lo sono dispositivi come il microscopio ottico a scansione di campo vicino .

Sarfus è una tecnica ottica recente che aumenta la sensibilità di un microscopio ottico standard fino al punto in cui è possibile visualizzare direttamente film nanometrici (fino a 0,3 nanometri) e nano-oggetti isolati (fino a 2 nm di diametro). La tecnica si basa sull'uso di substrati non riflettenti per la microscopia a luce riflessa a polarizzazione incrociata.

La luce ultravioletta consente la risoluzione di caratteristiche microscopiche e l'imaging di campioni trasparenti all'occhio. La luce nel vicino infrarosso può essere utilizzata per visualizzare i circuiti incorporati in dispositivi di silicio incollato, poiché il silicio è trasparente in questa regione di lunghezze d'onda.

Nella microscopia a fluorescenza molte lunghezze d'onda della luce che vanno dall'ultravioletto al visibile possono essere utilizzate per indurre i campioni a fluorescenza , che consente la visualizzazione a occhio o con telecamere specificamente sensibili.

Cellule non colorate visualizzate dal tipico campo chiaro (a sinistra) rispetto alla microscopia a contrasto di fase (a destra).

La microscopia a contrasto di fase è una tecnica di illuminazione al microscopio ottico in cui piccoli sfasamenti nella luce che passa attraverso un campione trasparente vengono convertiti in variazioni di ampiezza o contrasto nell'immagine. L'uso del contrasto di fase non richiede la colorazione per visualizzare il vetrino. Questa tecnica del microscopio ha permesso di studiare il ciclo cellulare nelle cellule vive.

Il microscopio ottico tradizionale si è evoluto più recentemente nel microscopio digitale . Oltre a, o al posto di, visualizzare direttamente l'oggetto attraverso gli oculari , viene utilizzato un tipo di sensore simile a quelli utilizzati in una fotocamera digitale per ottenere un'immagine, che viene poi visualizzata sul monitor di un computer. Questi sensori possono utilizzare la tecnologia CMOS o dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD), a seconda dell'applicazione.

La microscopia digitale con livelli di luce molto bassi per evitare danni a campioni biologici vulnerabili è disponibile utilizzando fotocamere digitali sensibili al conteggio dei fotoni . È stato dimostrato che una sorgente di luce che fornisce coppie di fotoni in entanglement può ridurre al minimo il rischio di danni ai campioni più sensibili alla luce. In questa applicazione dell'imaging fantasma alla microscopia a fotoni sparsi, il campione viene illuminato con fotoni infrarossi, ciascuno dei quali è correlato spazialmente con un partner impigliato nella banda visibile per imaging efficiente da una fotocamera per il conteggio dei fotoni.

Moderno microscopio elettronico a trasmissione

Electron

Micrografia elettronica a trasmissione di una cellula in divisione sottoposta a citochinesi

I due principali tipi di microscopi elettronici sono i microscopi elettronici a trasmissione (TEM) e i microscopi elettronici a scansione (SEM). Entrambi hanno serie di lenti elettromagnetiche ed elettrostatiche per focalizzare un fascio di elettroni ad alta energia su un campione. In un TEM gli elettroni passano attraverso il campione, analogamente alla microscopia ottica di base . Ciò richiede un'attenta preparazione del campione, poiché gli elettroni sono fortemente dispersi dalla maggior parte dei materiali. I campioni devono anche essere molto sottili (sotto i 100 nm) affinché gli elettroni possano attraversarli. Sezioni trasversali di cellule colorate con osmio e metalli pesanti rivelano membrane organelle e proteine ​​trasparenti come i ribosomi. Con un livello di risoluzione di 0,1 nm, è possibile ottenere viste dettagliate dei virus (20-300 nm) e un filamento di DNA (2 nm di larghezza). Al contrario, il SEM ha bobine raster per scansionare la superficie di oggetti sfusi con un sottile fascio di elettroni. Pertanto, il campione non deve essere necessariamente sezionato, ma potrebbe essere necessario un rivestimento con uno strato nanometrico di metallo o carbonio per i campioni non conduttivi. Il SEM consente l'imaging rapido della superficie dei campioni, possibilmente in vapore acqueo sottile per prevenire l'essiccazione.

Sonda di scansione

I diversi tipi di microscopi con sonda a scansione derivano dai molti diversi tipi di interazioni che si verificano quando una piccola sonda viene scansionata e interagisce con un campione. Queste interazioni o modalità possono essere registrate o mappate in funzione della posizione sulla superficie per formare una mappa di caratterizzazione. I tre tipi più comuni di microscopi con sonda a scansione sono microscopi a forza atomica (AFM), microscopi ottici a scansione in campo vicino (MSOM o SNOM, microscopia ottica a scansione in campo vicino) e microscopi a scansione a tunnel (STM). Un microscopio a forza atomica ha una sonda sottile, solitamente di silicio o nitruro di silicio, fissata a un cantilever; la sonda viene scansionata sulla superficie del campione e le forze che causano un'interazione tra la sonda e la superficie del campione vengono misurate e mappate. Un microscopio ottico a scansione di campo vicino è simile a un AFM ma la sua sonda è costituita da una sorgente di luce in una fibra ottica ricoperta da una punta che di solito ha un'apertura per il passaggio della luce. Il microscopio può catturare la luce trasmessa o riflessa per misurare proprietà ottiche molto localizzate della superficie, comunemente di un campione biologico. I microscopi a tunneling a scansione hanno una punta metallica con un singolo atomo apicale; la punta è attaccata a un tubo attraverso il quale scorre una corrente. La punta viene scansionata sulla superficie di un campione conduttivo fino a quando non scorre una corrente di tunneling; la corrente è mantenuta costante dal movimento del computer della punta e un'immagine è formata dai movimenti registrati della punta.

Superficie fogliare osservata da un microscopio elettronico a scansione.

Altri tipi

I microscopi acustici a scansione utilizzano le onde sonore per misurare le variazioni dell'impedenza acustica. Simili in linea di principio al sonar , vengono utilizzati per lavori come il rilevamento di difetti nelle sottosuperfici dei materiali, compresi quelli trovati nei circuiti integrati. Il 4 febbraio 2013, gli ingegneri australiani hanno costruito un "microscopio quantistico" che fornisce una precisione senza precedenti.

Guarda anche

Riferimenti

Primo microscopio a forza atomica

link esterno